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背景与目的:经典的骨髓增殖性肿瘤（MPN）是一类以一系或多系髓系细胞包括红系、粒系和巨核系增殖为主要特征的克隆性造血干细胞疾病,包括真性红细胞增多症（PV）、原发性血小板增多症（ET）、原发性骨髓纤维化（PMF）。JAK2、MPL、CALR基因突变是致MPN发生的主要驱动基因。JAK2、MPL、CALR基因突变主要受累MPN患者红系、粒-单系以及巨核系髓系细胞。从细胞层面研究者通过克隆实验证实JAK2、MPL、CALR基因突变主要发生在髓系造血干细胞阶段,导致由其发育而来的红系、粒-单系以及巨核系髓系细胞也携带JAK2、MPL、CALR基因突变。现有临床数据显示粒细胞数量增高是MPN骨髓纤维化主要临床表型;粒细胞数量增高是血栓并发症发生的主要危险因素,且被纳入临床评估血栓风险的主要依据。以上临床现象提示驱动突变受累粒细胞在MPN发生发展中发挥着一定的作用,我们并推测受累的粒细胞内部突变体与特异的网络信号发生相互作用进而产生不同于生理情况下粒细胞的功能,进而参与MPN疾病的发生发展过程。中性粒细胞碱性磷酸酶（NAP）是组织非特异性碱性磷酸酶或肝/骨/肾碱性酶磷酸酶基因的产物,储藏于胞浆分泌性囊泡,位于其膜表面上,与分泌性囊泡出现在成熟最晚阶段的分叶核中性粒细胞。中性粒细胞分化越成熟,功能越活跃,NAP表达越高,故NAP表达高低为中性粒细胞成熟程度的一个重要标志。MPN患者中NAP也表现为异常表达,我们推测这种异常表达的病理改变可能参与了MPN疾病的发生发展,其具体病理意义需要进一步探究。早先有研究者证实了JAK2V617F突变可使PV、ET、PMF患者NAP表达增高,从分子水平上阐释了MPN患者NAP增高的分子基础。但后发现的MPL、CALR突变对MPN患者中性粒细胞NAP的影响并不清楚。鉴于此,本课题将对MPN各驱动突变基因对中性粒细胞NAP表达的影响进行阐释。方法:1.骨髓增殖性肿瘤驱动突变基因对NAP表达影响的临床研究（1）收集本院就诊的MPN初诊患者,研究纳入条件为:初诊时未使用任何MPN疾病相关的降细胞或阿司匹林治疗;初诊时具有本院NAP检测结果记录;伴有JAK2、MPL、CALR基因突变且功能阳性。（2）患者JAK2V617F基因突变检测采用等位基因特异性PCR方法;JAK2 exon12、MPL exon10、CALR exon9突变检测采用PCR联合Sanger一代测序法。（3）患者NAP检测采用中性粒细胞碱性磷酸酶化学染色法。（4）患者JAK2V617F突变负荷检测采用数字PCR进行定量。2.骨髓增殖性肿瘤驱动突变基因对NAP表达影响的细胞模型研究（1）细胞模型构建应用慢病毒过表达载体系统转导JAK2野生型（JAK2WT）、JAK2突变型（JAK2V617F）、MPL野生型（MPLWT）、MPL突变型（MPLW515L、MPLA497-L498LVIAins4）、CALR野生型（CALR WT）、CALR突变型（CALRType1、CALR Type2）、空载体（MSCV）于NB4细胞株。（2）细胞模型NAP表达应用ATRA和G-CSF联合诱导培养不同时间点。（3）细胞模型NAP检测采用磷酸对硝基苯酯（p NPP）法进行定量。3.蛋白质组学和磷酸化修饰蛋白组学研究骨髓增殖性肿瘤驱动突变基因调控NAP表达的机制（1）收集经ATRA和G-CSF联合诱导培养96h的NB4-JAK2V617F、NB4-MPLW515L、NB4-CALR Type1、NB4-MSCV细胞模型,应用液相色谱-质谱联用检测各组细胞蛋白质组学和磷酸化修饰蛋白组学。（2）GO蛋白注释来源于Uni Prot-GOA数据库;蛋白结构域注释使用软件Inter Pro Scan以及相应的Inter Pro结构域数据库;KEGG通路注释使用KEGG在线服务工具KAAS;亚细胞定位注释使用预测亚细胞定位的软件wolfpsort。修饰位点的基序特征分析使用软件Mo Mo,motif-x算法。（3）蛋白质功能富集使用Fisher’s exact test。基于蛋白功能富集的聚类分析使用R语言包gplots中的函数heatmap.2绘制热图。蛋白互作网络分析使用STRING（v.10.5）蛋白网络互作数据库比对。表达模式聚类分析使用Mfuzz聚类方法。磷酸化位点上游激酶预测使用i GPS1.0软件。磷酸激酶活性预测使用GSEA方法。结果:1.骨髓增殖性肿瘤驱动突变基因对NAP表达影响的临床研究（1）MPN各亚型患者NAP积分值及阳性率的比较所有111例PV患者NAP积分值增高;180例ET患者中135例增高,16例正常值范围内,29例减低;97例PMF患者中72例增高,6例正常范围内,19例减低。PV组患者与ET组患者相比有统计学差异（P＜0.0001）,PV组患者与PMF组患者相比有统计学差异（P＜0.0001）,ET组患者与PMF组患者相比无统计学差异（P=0.0508）。所有111例PV患者NAP阳性率增高;180例ET患者中147例增高,13例正常值范围内,20例患者减低;97例PMF患者中75例增高,6例正常值范围内,16例减低。PV组患者与ET组患者相比有统计学差异（P＜0.0001）,PV组患者与PMF组患者相比有统计学差异（P＜0.0001）,ET组患者与PMF组患者相比无统计学差异（P=0.5755）。（2）MPN各突变患者NAP积分值、阳性率及平均积分值的比较所有313例JAK2V617F突变患者、3例JAK2 exon12突变患者NAP积分值均增高;14例MPL突变患者中2例增高,2例患者正常值范围内,10例患者减低;58例CALR突变患者中1例增高,20例正常值范围内,37例减低。所有JAK2突变组（包含JAK2V617F、JAK2 exon12）与MPL突变组、CALR突变组相比均有统计学差异（P＜0.0001）,MPL突变组与CALR突变组相比无统计学差异（P=0.4634）,JAK2V617F突变组与JAK2 exon12突变组相比无统计学差异（P=0.9040）。所有313例JAK2V617F突变患者、3例JAK2 exon12突变患者NAP阳性率增高;14例MPL突变患者中2例增高,2例正常值范围内,10例减低;58例CALR突变患者中14例增高,17例正常值范围内,27例减低。所有JAK2突变组NAP阳性率与MPL突变组、CALR突变组相比均有统计学差异（P＜0.0001）,MPL突变组与CALR突变组相比无统计学差异（P=0.4678）,JAK2V617F突变组与JAK2 exon12突变组相比无统计学差异（P=0.1046）。JAK2V617F突变患者NAP平均积分值中位数2.000（1.070-3.870）,JAK2exon12突变患者2.580（1.920-2.970）,MPL突变患者1.085（0-1.750）,CALR突变患者1.065（0-1.970）。所有JAK2突变组（包含JAK2V617F、JAK2 exon12）与MPL突变组、CALR突变组相比有统计学差异（P＜0.0001）,MPL突变组与CALR突变组相比无统计学差异（P=0.8281）,JAK2V617F突变组与JAK2 exon12突变组相比无统计学差异（P=0.2145）。（3）各突变MPN亚型NAP积分值、阳性率及平均积分值的比较所有108例JAK2V617F-PV、133例JAK2V617F-ET、72例JAK2V617F-PMF、JAK2 exon12-PV患者NAP积分值均增高;10例MPL-ET患者中2例增高,2例正常值范围内,6例减低;所有4例MPL-PMF患者减低;37例CALR-ET突变患者中1例增高,14例患者正常值范围内,22例减低;21例CALR-PMF突变患者中6例正常值范围内,15例患者NAP减低。JAK2V617F-PV组NAP积分值与JAK2V617F-ET组相比有显著统计学差异（P＜0.0001）,但与JAK2V617F-PMF、JAK2 exon12-PV组均无显著统计学差异（P＞0.05）;JAK2V617F-PV、JAK2V617F-ET、JAK2V617F-PMF、JAK2exon12-PV组均依次高于MPL-ET、MPL-PMF、CALR-ET、CALR-PMF组患者,均具有显著统计学差异（P＜0.05）;但MPL-ET、MPL-PMF、CALR-ET、CALR-PMF组患者两两之间之间均无显著统计学差异（P＞0.05）。所有JAK2V617F-PV、JAK2V617F-ET、JAK2V617F-PMF、JAK2 exon12-PV患者NAP阳性率均增高;10例MPL-ET患者中4例增高,1例正常值范围内,5例减低;所有4例MPL-PMF患者减低;37例CALR-ET突变患者中10例增高,12例正常值范围内,15例减低。21例CALR-PMF突变患者中3例增高,6例正常值范围内,12例减低。JAK2V617F-PV组患者NAP阳性率与JAK2V617F-ET组患者相比有显著统计学差异（P＜0.0001）,JAK2V617F-ET、JAK2V617F-PMF、JAK2 exon12-PV两两之间比较均无显著统计学差异（P＞0.05）,JAK2V617F-PV、JAK2V617F-ET、JAK2V617F-PMF、JAK2exon12-PV组均依次高于MPL-ET、MPL-PMF、CALR-ET、CALR-PMF,具有显著统计学差异（P＜0.05）,但MPL-ET、MPL-PMF、CALR-ET、CALR-PMF两两之间比较均无显著统计学差异（P＞0.05）。JAK2V617F-PV患者NAP平均积分值中位数2.265（1.220-3.520）,JAK2V617F-ET患者1.820（1.070-3.470）,JAK2V617F-PMF患者2.100（1.190-3.780）,JAK2 exon12患者2.580（1.920-2.970）,MPL-ET患者1.200（0-1.750）,MPL-PMF患者NAP 1.000（1.000-1.330）,CALR-ET患者1.110（0-1.930）,CALR-PMF患者1.000（0-1.970）。JAK2V617F-PV、JAK2V617F-PMF、JAK2exon12-PV患者NAP平均积分值均高于JAK2V617F-ET组患者,有显著统计学差异（P＜0.05）;JAK2V617F-PV、JAK2V617F-ET、JAK2V617F-PMF、JAK2exon12-PV组平均积分值均高于MPL-ET、MPL-PMF、CALR-ET、CALR-PMF组患者,有显著统计学差异（P＜0.05）;但MPL-ET、MPL-PMF、CALR-ET、CALR-PMF组患者平均积分值之间均无显著统计学差异（P＞0.05）。（4）JAK2V617F突变负荷与NAP表达的相关性分析61例患者中,PV为26例,ET为18例,PMF为17例。PV患者与PMF患者JAK2V617F突变负荷显著高于ET患者,分别有显著统计学差异（P=0.0023,P=0.0018）,而PV与PMF之间无显著差异。PV患者与PMF患者NAP积分值显著高于ET患者,分别有显著统计学差异（P＜0.0001,P=0.0020）,而PV与PMF之间无显著差异。直线相关分析显示61例患者突变负荷与NAP积分值呈显著正相关,即NAP积分值随突变负荷增高而增高,且有显著统计学意义（r~2=0.1919,P=0.0005）。PV患者与PMF患者NAP阳性率显著高于ET患者,分别有显著统计学差异（P＜0.0001,P=0.0247）,而PV与PMF之间无显著差异。直线相关分析显示61例患者突变负荷与NAP阳性率呈正相关,即NAP阳性率随突变负荷增高而增高（r~2=0.09692,P=0.0184）。PV患者与PMF患者NAP平均积分值显著高于ET患者,分别有显著统计学差异（P=0.0062,P=0.0115）,而PV与PMF之间无显著差异。直线相关分析显示61例患者突变负荷与NAP平均积分值呈显著正相关,即NAP平均积分值随突变负荷增高而增高,且有显著统计学意义（r~2=0.2428,P＜0.0001）。2.骨髓增殖性肿瘤驱动突变基因对NAP表达影响的细胞模型研究（1）JAK2突变基因及对照基因NB4细胞模型经诱导后NAP表达的比较随着诱导分化时间延长,NB4组、NB4-MSCV组、NB4-JAK2WT组、NB4-JAK2V617F组NAP表达量均呈逐渐增高;NB4-JAK2V617F组在48h开始高于各对照组;诱导96h时,NB4-JAK2V617F组NAP表达量显著高于各对照组。（2）MPL突变基因及对照基因NB4细胞模型经诱导后NAP表达的比较随着诱导分化时间延长,NB4组、NB4-MSCV组、NB4-MPLWT组NAP表达量呈逐渐增高,NB4-MPLW515L组与NB4-MPLA497-L498LVIAins4组表达变化不明显;诱导96h开始,NB4-MPLW515L、NB4-MPLA497-L498 LVIAins4突变组分别与NB4、NB4-MSCV、NB4-MPLWT对照组之间有统计学差异。（3）CALR突变基因及对照基因NB4细胞模型经诱导后NAP表达的比较随着诱导分化时间延长,NB4组、NB4-MSCV组、NB4-CALRWT组NAP表达量呈逐渐增高,NB4-CALRtype1组与NB4-CALRtype2组表达变化不明显;诱导96h开始,NB4-CALRtype1、NB4-CALRtype2突变组分别与NB4、NB4-MSCV、NB4-CALRWT对照组相比有统计学差异。3.蛋白质组学和磷酸化修饰蛋白组学研究骨髓增殖性肿瘤驱动突变基因调控NAP表达的机制（1）各突变组细胞模型蛋白质组学结果分析将NB4-JAK2V617F、NB4-MPLW515L、NB4-CALR Type1突变模型差异蛋白进行功能富集,根据富集结果进行聚类分析。结果显示无符合筛检标准的显著富集差异蛋白。（2）各突变组细胞模型磷酸化修饰蛋白质组学结果分析将NB4-JAK2V617F、NB4-MPLW515L、NB4-CALR Type1突变模型差异磷酸化位点对应蛋白进行功能富集,根据富集结果进行聚类分析。结果显示无符合筛检标准的显著富集差异磷酸化位点对应蛋白。表达模式聚类分析结果显示有3个显著差异表达的磷酸化位点MESD-S221（Protein ID:Q14696）、RAB11FIP1-S156（Protein ID:Q6WKZ4）、NDRG1-T346（Protein ID:Q92597）,其中MESD-S221上调于JAK2V617F组并下调于MPL和CALR突变组、而RAB11FIP1-S156和NDRG1-T346下调于JAK2V617F组并上调于MPL和CALR突变组。磷酸化位点的上游磷酸激酶预测结果显示NDRG1-T346相关的上游激酶有41个,我们经Pubmed数据库分析41个激酶中PKN1激酶可表达于中性粒细胞,其余激酶不表达于中性粒细胞。继续将预测的NDRG1-T346上游激酶PKN1的激酶活性进行筛检,该激酶活性在上述23个激酶中,其在JAK2V617F组中倾向抑制状态,在MPL和CALR突变组中无变化。MESD-S221和RAB11FIP1-S156均未预测到其相关的上游激酶。结论:1.通过对MPN各亚型患者NAP指标比较分析,我们发现几乎所有PV患者NAP是增高的,但ET和PMF患者中约80%以上患者表现为NAP增高,约20%患者表现为NAP显著减低。提示MPN患者NAP表达呈异质性,与以往传统认为MPN患者NAP增高的观点不同。2.通过对JAK2、MPL、CALR各驱动突变患者NAP各指标比较分析,我们证实MPN患者NAP差异表达的异质性与JAK2、MPL、CALR驱动突变显著相关,即JAK2突变表现为NAP增高,MPL和CALR突变表现为NAP减低或表达抑制。提示JAK2、MPL、CALR驱动突变可能是MPN患者NAP表达变化的内在分子基础。3.通过对JAK2突变在MPN不同亚型中NAP各指标比较分析,我们发现中性粒细胞内JAK2V617F突变负荷越高则NAP表达越高;JAK2exon12杂合突变对NAP影响程度与AK2V617F纯合突变负荷状态下影响程度相当。提示JAK2突变负荷、JAK2不同位点的突变对NAP表达的影响程度也有所不同。4.本部分研究我们通过慢病毒转导技术分别构建了JAK2、MPL、CALR各突变型及野生型过表达NB4模型,结果显示JAK2突变可促进NAP显著增高,MPL和CALR突变则显著抑制NAP表达。该模型证实了JAK2、MPL、CALR驱动突变与NAP的因果调控关系,且与前期临床数据结论一致。5.通过蛋白质组学层面的解析,我们在NB4-JAK2V617F、NB4-MPLW515L、NB4-CALR Type1各突变组细胞模型中未发现显著富集差异表达蛋白分子。提示JAK2突变与MPL、CALR差异调控NAP的内在机制可能并没有通过引起下游信号分子表达水平增高而传递信号,而主要是调控磷酸化位点水平。6.通过磷酸化修饰蛋白质组学层面的解析,我们在NB4-JAK2V617F、NB4-MPLW515L、NB4-CALR Type1各突变组细胞模型中发现了3个显著富集差异表达磷酸化位点,即MESD-S221、RAB11FIP1-S156、NDRG1-T346,并对其进行了上游磷酸激酶预测以及功能分析。数据提示3个磷酸化位点均有可能参与JAK2突变与MPL、CALR差异调控NAP的内在机制。