背景子宫内膜异位症(endometriosis, EMs)指具有生长功能的子宫内膜出现在宫腔被覆黏膜以外部位的一种疾病，主要表现为不孕及慢性盆腔疼痛，严重影响育龄妇女的生活质量。目前发病率呈上升趋势，约为6%~10%，发病机制未明确。通常所使用的手术与药物结合的治疗方法效果不理想，2年复发率高达40%以上。因此，探索EMs更有效的治疗措施成为当今妇科及生殖研究的热点。研究发现，组织因子(Tissue Factor, TF)不仅启动凝血级联反应，而且通过激活下游受体蛋白酶激活受体-2(proteinase activated receptors, PAR-2)介导细胞信号传导，调节恶性肿瘤的血管、炎症微环境生成，促进恶性肿瘤的发生发展。而EMs具有类似恶性肿瘤的某些生物学特征，如血管生成、侵袭、局部远处转移等。近年来，研究发现EMs的异位、在位内膜中的TF蛋白及在位内膜的PAR-2蛋白表达显著升高。国外学者提出TF/PAR-2信号通路可能参与EMs的发病过程。PAR-2基因敲除鼠模型的研究也表明，该动物模型可明显抑制EMs的发展。由于TF/PAR-2信号通路在EMs上研究较少，研究TF及PAR-2在EMs中的表达及其与月经周期的关系如何，有助于进一步了解EMs的发病机制及寻找治疗EMs的新靶点。探索利用该靶点行特异性抗体靶向治疗EMs的可行性，为EMs的抗血管、炎症生成抗体治疗提供理论和实验研究。目的临床研究EMs异位、在位内膜中TF、PAR-2的表达及TF/PAR-2信号与月经周期的关系，探讨TF/PAR-2信号在EMs发病中的作用。构建及利用可视化EMs裸鼠荧光模型，探索PAR-2拮抗剂ENMD-1068治疗EMs的作用及其可能的机制，为发展靶向性、特异性的抗体治疗EMs提供理论和实验依据。（一）组织因子及蛋白酶激活受体2在子宫内膜异位症的表达及意义方法1.资料的收集及标本的获取选择2010年9月至2011年7月于广州医学院第三附属医院、南方医科大学珠江医院42例EMs腹腔镜手术治疗的患者，术中及术后病理证实为EMs，其中留取异位内膜40例及在位内膜20例；同期20例因单纯性卵巢囊肿行腹腔镜手术治疗的患者为对照组，留取其宫腔内膜组织。所有患者均排除子宫肌瘤、子宫腺肌病等雌激素相关性疾病，术前6个月未使用激素类药物及宫腔内放置节育器(如促性腺激素释放激素，口服避孕药等)。本研究经两院伦理委员会批准，所有内膜提供者均知情同意。2.检测各组内膜组织的TF、PAR-2表达利用免疫组化法检测各组内膜组织的TF蛋白、PAR-2蛋白表达，根据阳性率和表达强度进行量化评分(Hscore评分)；实时荧光定量PCR法检测TF mRNA及PAR-2mRNA表达水平。结果1. EMs异位、在位内膜TF、PAR-2的蛋白表达均主要位于腺上皮细胞的胞膜和胞浆中，少数病例见间质表达。与正常人子宫内膜组比较，异位、在位内膜组TF及PAR-2的总蛋白及总mRNA水平均显著升高(P<0.05)。异位内膜组TF、PAR-2的总蛋白及总mRNA表达与在位内膜组比较差异无统计学意义(P>0.05)。2.增殖期与分泌期中，异位内膜组TF、PAR-2的蛋白及mRNA的表达量和在位内膜组TF蛋白及mRNA的表达量均显著高于正常子宫内膜组(P<0.05)。分泌期中，在位内膜组PAR-2的蛋白及mRNA的表达量高于正常子宫内膜组(P<0.05)，而其在增殖期的表达量与正常内膜组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。三组内膜TF、PAR-2的蛋白及mRNA在增殖期中的表达量与同组分泌期比较，统计无差异(P>0.05)。结论1. EMs异位、在位内膜TF及PAR-2的蛋白及mRNA的异常表达可能与EMs的发生发展有关，他们可能是研究分子靶向治疗EMs新的靶点。2.在位内膜分泌期中TF及PAR-2的异常表达提示在位内膜原发性功能异常，在位内膜异常的TF/PAR-2信号可能与EMs的发病有关，为我们进一步研究EMs发病机制提供新的理论依据。（二）ENMD-1068治疗子宫内膜异位症的动物实验研究方法1.子宫内膜组织标本的获取与内膜的准备收集2011年8月至2011年10月于广州医学院第三附属医院、南方医科大学珠江医院腹腔镜下18例EMs患者分泌期的在位内膜，纳入标准同上。无菌PBS漂洗后，培养皿内剪成1mm3~2mm3碎块。2.编码红色荧光蛋白慢病毒(LV-CMV-RFP)转染5个组织块置于48孔板的1个孔内，加入整合了增强型红色荧光蛋白的慢病毒颗粒(LV-CMV-RFP)，终浓度为1×108PFU/mL，37℃、5%CO2培养箱环境下感染24h后将子宫内膜组织收集，PBS冲洗。3.荧光人EMs裸鼠模型制作与观察(1)选取6~8周龄BABL/C雌性裸鼠，随机腹腔内种植10~12块LV-CMV-RFP的组织。种植后连续3天肌注苯甲酸雌二醇0.02mg/d促进内膜生长，青霉素1000U/d预防感染。8~10天后活体成像系统下拍照或开腹观察成瘤情况。(2)预实验9只：建模成功鼠建模术后第10~12d(手术当天不算)予随机分3组：即NS组=生理盐水(NS)0.2ml/d；PAR-2拮抗剂ENMD-1068：E0.5组=ENMD-10680.5mg/d；E1.0组=ENMD-10681.0mg/d。药物腹腔注射后分别于第1，3，5d，NS组、E0.5及E1.0组各取1只小鼠予颈椎脱臼法处死，取出病灶。初步判断是否成瘤及疗效观察。预实验组每组3只，分笼饲养。(3)实验组25只(其中1只建模失败)：成模鼠24只，建模术后第10~12d予随机分3组(手术当天不算)，每组8只。每天腹腔注射药物剂量同预实验，即NS组=NS0.2ml/d×5d；E0.5组=ENMD-10680.5mg/d×5d；E1.0组=ENMD-10681.0mg/d×5d。每周称裸鼠体重。每天观察裸鼠进食、毛色、活动情况。4.在末次腹腔注射药物后第6d即内膜植入术后第16~18d处死小鼠，测量异位病灶体积及无菌收集，立刻放入0.5ml无菌、无抗生素M199培养液(pH=7.4)中，置于37℃温箱培养2h，收集组织培养液，ELISA检测白介素(IL)-6，单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)。5.免疫组化法检测血管内皮生长因子(VEGF)、核转录因子-kB(NF-kB)、Ki-67。6. TUNEL细胞凋亡检测。7. HE染色检测裸鼠重要脏器心、肝、脾、肺、肾、子宫及卵巢的形态学改变。结果1.成功构建人子宫内膜异位症可视化动物模型：(1)实验组腹腔种植鼠共25只：成模24只(96%)(即24只裸鼠，每只裸鼠通过活体成像系统观察或开腹探查病灶，病理证实异位子宫内膜)，成活率100%。其中，建模第8~10d体外荧光探测见荧光病灶鼠12只(48%)(图2-2)，无荧光鼠予开腹探测见肉眼病灶12只(48%)，无荧光、无肉眼病灶鼠1只为建模失败(4%)。(2) NS组(图2-3A、B)，E0.5组(图2-3D)各约1~3处病灶不等，分布于前腹膜、侧腹膜，脂肪(膀胱旁)、盆腔深部，少数见肠管表面生长(图2-3D)。移植内膜与裸鼠盆腹腔组织牢固粘附，隆起明显，血管网在黏附区域发育良好，病灶与其周旁组织呈融合状态，与肠管轻度粘连能够分离(图2-3C)。E1.0组异位病灶萎缩成近扁平的斑块状物或粗糙面痕迹，未见显著粘连(图2-3E)。(3)镜下观察E0.5(图2-4B)、E1.0组(图2-4C)较NS组(图2-4A)腺体数目减少，腺腔变窄，细胞稀疏呈萎缩状态，部分间质伴有不同程度的炎症及坏死。2.异位病灶体积比较：E0.5、E1.0组裸鼠的异位病灶平均体积较NS组显著降低(P<0.05)，且体积改变呈剂量依赖性，E0.5与NS组，E1.0与NS组，E1.0与E0.5组的病灶体积比较有显著性意义(P<0.05)(图2-5)。3. ELISA检测： E0.5、 E1.0组裸鼠异位内膜组织培养液IL-6、MCP-1浓度(pg/mg/2h)较NS组显著降低(P<0.05)。 E1.0组异位内膜组织培养液IL-6的浓度(pg/mg/2h)较E0.5组降低(P<0.05)(图2-6)。4. E0.5、E1.0组异位内膜VEGF、NF-kB和Ki-67表达均明显低于NS组(图2-7，2-8)(P<0.05)。E1.0组异位内膜NF-kB和Ki-67的表达弱于E0.5组，差异有统计学意义(P<0.05)。5. TUNEL法检测细胞凋亡率：E0.5、E1.0组异位内膜细胞凋亡率较NS组显著升高，E1.0组异位内膜细胞凋亡率显著高于E0.5组(P<0.05)(图2-9，2-10)。6. ENMD-1068对全身重要脏器的影响：给药后第6天，对E0.5、E1.0组裸鼠的心、肝、脾、肺、肾、子宫及卵巢组织进行显微镜下观察，未见缺血、坏死和炎症反应改变(图2-11)。结论1.采用编码红色荧光蛋白的慢病毒(LV-CMV-RFP)转染人子宫内膜，采用腹腔种植法建立的EMs裸鼠模型具有可视化、无创损伤、模拟人类EMs的发病特点，为EMs治疗研究提供有效实验工具。2.采用PAR-2拮抗剂ENMD-1068明显抑制EMs裸鼠模型异位病灶的生长并诱导其凋亡而缩小病灶，且这种作用呈剂量依赖。下调VEGF、NF-kB、Ki-67的表达及抑制炎症介质IL-6，MCP-1的表达可能为ENMD-1068治疗EMs的分子机制之一。3. ENMD-1068对EMs裸鼠重要脏器如心、肝、脾、肺、肾及子宫、卵巢无影响，但其引起的过敏反应或毒性作用尚需进一步研究。PAR-2拮抗剂可能成为EMs抗体靶向治疗的新选择。