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研究背景及目的:神经母细胞瘤（neuroblastoma,NB）起源于胚胎时期外胚层的神经嵴干细胞。其中,肾上腺源性神经母细胞瘤所占的比例最高,是小儿外科及泌尿外科恶性程度较高,患者生存预后较差的实体肿瘤。目前的神经母细胞瘤的良恶性评估以MYCN基因的高表达程度为重要的参考指标。MYCN高表达神经母细胞瘤的高恶性机制目前已有较多的研究对其进行了阐述。然而,与之相对应的,MYCN低表达的神经母细胞瘤患者,据统计有十分良好的预后,甚至能够达到长期带瘤生存的状态。然而使神经母细胞瘤患者具有良好预后的相关影响因素及机制目前尚未得到全面的研究,其中,Trk通路目前正在逐渐被学者重视。本研究通过对GEO数据库中的神经母细胞瘤单细胞转录组测序的再分析,并根据已有的肾上腺单细胞测序研究基础,从单细胞的层面对神经母细胞瘤进行MYCN高表达型及NTRK1高表达型的细分类,挖掘神经母细胞瘤细胞亚群间的内在差异,寻找潜在影响肿瘤预后的关键靶点。依据神经母细胞瘤的肾上腺起源性为主的特点,深入地挖掘肾上腺激素DHEA与Trk通路对神经母细胞瘤预后的影响机制。为今后神经母细胞瘤的临床个性化治疗提供了重要的分子生物学机制理论支持。方法:（1）本次研究通过已有的肾上腺单细胞测序的研究基础,以及GEO公共数据库下载2020年9月发表在Cancer Cell杂志上的神经母细胞瘤单细胞测序原始样本数据的再分析,选择的数据样本编号分别为T162、T174、T188、T200、T214。（2）运用Cell Ranger软件进行原始数据上游分析矩阵构建及Seurat包进行质量控制筛选及后续的降维、细胞聚类分析。运用Infer CNV包对细胞拷贝数变异情况分析,运用STRINGdb包进行细胞类群内部蛋白互作网络分析,运用Nichenetr包进行活性配受体互作网络分析,运用cluster Profiler包及Cytoscape软件中的Clue GO包进行基因功能富集分析,结合TCGA数据库对风险相关候选基因进行生存分析。（3）MTT实验检测经过DHEA、DHT及Am80刺激后的SK-N-BE（2）（MYCN扩增型神经母细胞瘤细胞株）神经母细胞瘤细胞株及SH-SY5Y（MYCN非扩增型神经母细胞瘤细胞株）神经母细胞瘤细胞株的细胞活性。ELISA法测DHEA刺激后SK-N-BE（2）及SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞株的睾酮（T）含量。q PCR法检测经过DHEA、DHT及Am80刺激后的SK-N-BE（2）神经母细胞瘤细胞株及SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞株的肿瘤预后相关转录因子的表达水平变化。Western blot法检测经过DHEA、Am80及GW441756刺激后的SK-N-BE（2）神经母细胞瘤细胞株的肿瘤预后相关蛋白质的表达水平变化。结果:（1）在对神经母细胞瘤细胞数据进行严格质量控制及筛选之后,最终纳入研究的细胞数为72,233个,随后经过细胞聚类分析,能够划分为24个细胞小类及9组主要细胞类型。这9种主要细胞类群分别是:肿瘤细胞类群为MYCN高表达神经母细胞瘤细胞类群及NTRK1高表达神经母细胞瘤细胞;非肿瘤细胞类群为前施旺氏细胞前体细胞（pre-Shwann cell precursors,SCPs）、嗜铬细胞、SST+嗜铬细胞、交感神经细胞及bridge细胞、增殖性神经细胞、髓系免疫细胞、肾上腺类固醇细胞。（2）运用infer CNV分析包,得出MYCN高表达及NTRK1高表达的神经母细胞瘤细胞类群具有较高的拷贝数变异情况,验证了我们所定义的肿瘤细胞类群的准确性。（3）运用STRINGdb包发现了MYCN高表达神经母细胞瘤内部的MYCN编码蛋白与CDK1、MKI67、NFIB、POLR3K、NME1等基因编码蛋白存在复杂的蛋白互作网络,提示这一神经母细胞类群的较高增殖活性及侵袭性。发现在NTRK1高表达神经母细胞内部的NTRK1编码蛋白与SHC1、TH、DBH等基因编码蛋白存在复杂互作网络,提示这一神经母细胞瘤类群内部的调控凋亡及介导神经营养相关通路的功能活跃,预实着其良好的预后。这两类神经母细胞瘤的细胞内部特异性调控网络的关键蛋白编码基因对肿瘤的预后影响结果,在以TCGA数据库为基础的Kaplan-Meier生存分析曲线图得到进一步证实。（4）运用Nichenetr包进行活性配受体互作网络分析,我们发现在肿瘤及非肿瘤状态之下具有高活性的潜在配受体互作对,其中NTRK1、NCSTIN、NRXN1、INSR、TGFBR1、SFRP1等基因具有较高的靶基因活性。将所有的潜在靶基因运用Cytoscape软件中的Clue Go包进行综合性基因功能富集分析,发现这些高活性配受体的功能主要体现在神经系统的正常发育成熟、神经系统功能调控、类固醇代谢调控、炎性反应的介导、Wnt信号通路的相关激活等。（5）DHEA、Am80及DHT对SK-N-BE（2）与SH-SY5Y细胞系进行刺激后,发现细胞增殖活性在整体上起到抑制作用。提示DHEA可能通过DHEA-Trk通路转化为高活性DHT的或其他方式对神经母细胞瘤的预后进行调控。（6）检测DHEA、Am80及DHT对SK-NBE（2）与SH-SY5Y细胞转录组表达影响。发现DHEA-Trk对SH-SY5Y神经母细胞瘤（MYCN非扩增型）通过激活Trk A-NGF通路抑制肿瘤恶性;反之,在SK-N-BE（2）神经母细胞瘤细胞株（MYCN扩增型）中通过激活Trk BBDNF通路促进肿瘤恶性。同时,DHEA能够通过转化为DHT对这两神经母细胞瘤细胞株都起到抑制恶性。（7）检测DHEA、Am80及GW441756对SK-N-BE（2）细胞蛋白表达影响。本研究发现DHEA的刺激整体上能够降低SK-N-BE（2）细胞株的MYCN、ERK的蛋白表达,增加AKT、SSTR2及TH的表达。在对SK-N-BE（2）进行Am80及GW441756的刺激后结果分析,得出Trk A通路能够使S100B（神经细胞祖细胞marker蛋白）蛋白的表达增加及MYCN表达的降低,揭示了Trk A驱动SK-N-BE（2）细胞株由高恶性神经母细胞瘤细胞向良性前施旺氏细胞前体细胞进行去分化的结果。（8）检测DHEA刺激后SK-N-BE（2）及SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞株的睾酮（T）含量随DHEA的浓度梯度升高而升高,提示神经母细胞瘤细胞能够将DHEA转化为高生物活性雄激素的能力。结论:本研究借助已发表的神经母细胞瘤的单细胞测序研究原始数据,对神经母细胞瘤的单细胞图谱进行了个性化再分析,从单细胞的层面对神经母细胞瘤细胞亚群间的内在转录表达及蛋白互作网络间的差异进行进一步挖掘。系统性探究了肾上腺类固醇激素DHEA与神经母细胞瘤关键预后因素Trk通路的内在联系,为今后通过肾上腺类固醇激素对不同类型神经母细胞瘤进行个性化治疗提供了新的线索。