研究背景和目的:破骨细胞的过度形成和活化可导致多种溶骨性病变,如炎症诱导的骨破坏、骨质疏松、Peget’s病、肿瘤骨溶解等。骨稳态是一个动态的过程,参与其动态平衡调节过程的包括两大主要角色,即从骨髓间充质祖细胞分化来的成骨细胞介导骨形成和源自造血干细胞的破骨细胞介导骨吸收。而如今临床针对破骨细胞骨溶解的药物基本上都不是靶向药,有很多不明确的副作用,因此应用也不是很广泛,对此研发针对破骨细胞骨溶解副作用又小的药物是亟待解决的问题。在我们的前期研究中,氮掺杂碳点（Nitrogen-doped carbon dots,N-CDs）是由壳聚糖水解和不饱和的丙烯酰胺或羧酸聚合然后交联碳化而成,属于一种荧光纳米成像材料,具有优异的体内生物相容性。研究报道氮掺杂碳点能有效下调活性氧（reactive oxygen species,ROS）水平,通过减少内源/外源ROS,起到氧化应激的保护作用,而ROS是参与调节破骨细胞发育、分化和吸收功能的重要第二信使。本课题将通过氮掺杂碳点下调ROS的作用机制、破骨细胞的形成和骨吸收功能的影响,以及通过建立骨溶解动物模型探究氮掺杂碳点对破骨细胞异常引起的骨丢失的挽救效果三方面来阐述氮掺杂碳点对ROS和破骨细胞调控的分子作用机制。本课题的研究成果可为抗氧化纳米材料的临床转化和新型抗氧化纳米材料的研发提供理论依据。实验方法:通过加强碳碳双键合成高产率氮掺杂碳点（N-CDs）,确定活性氧清除率最高的壳聚糖比例,以及对氮掺杂碳点结构进行表征。体外实验:提取小鼠胫骨的骨髓单核巨噬细胞（bone marrow macrophages,BMMs）,通过ROS试剂盒检测N-CDs的ROS清除率,并检测DPPH清除率,接着通过western blot和RT-PCR实验方法检测N-CDs作用于破骨细胞后抗氧化酶蛋白和基因的表达。接下来利用MTS试剂检测N-CDs对BMMs增殖的作用,接下来通过抗酒石酸染色探究N-CDs处理后对破骨细胞分化的影响,以及利用RT-PCR技术定量分析破骨特异性基因表达的影响,紧接着检测N-CDs对破骨细胞的骨架以及发挥吸收功能的影响。最后,通过western blot和入核实验探究N-CDs影响破骨细胞的分子机制,ALP实验研究N-CDs对成骨细胞的影响。体内实验:小鼠脂多糖（LPS）诱导的颅骨局部骨溶解模型:8周龄c57雄鼠随机分成3组,空白对照组、LPS组、LPS+N-CDs处理组,1周后收集小鼠颅骨,Micro-CT扫描和组织分析,HE染色、TRAP染色和CTSK、RUNX2、osteocalcin免疫组织化学染色观察小鼠组织学形态变化。裸鼠乳腺癌诱导的胫骨局部骨溶解模型:8周龄雌性裸鼠随机分成3组,空白对照组、肿瘤组、肿瘤+N-CDs处理组,4周后收集裸鼠样本,Micro-CT扫描和组织分析裸鼠骨量变化,HE染色和TRAP染色观察小鼠组织学形态情况。结果:本次研究中,基于ROS作为激活破骨细胞分化和骨吸收的重要第二信使,我们首先合成具有高产率和强氧自由基清除率的氮掺杂碳点,然后验证N-CDs可以抑制细胞中活性氧的生成,接着我们通过体外实验证明了N-CDs增强了抗氧化酶蛋白以及抗氧化基因的表达,并验证了N-CDs削弱了破骨细胞分化以及骨吸收功能,并抑制了破骨细胞特异性基因的表达。我们发现N-CDs有效地消除了RANKL诱导的ROS生成,从而削弱了ROS下游NF-κB和MAPK信号级联通路的激活。在体内实验中,N-CDs能有效保护小鼠LPS诱导的颅盖骨骨溶解以及裸鼠乳腺癌诱导的胫骨骨溶解。基于N-CDs良好的生物相容性和有效清除ROS的能力,以及抑制破骨细胞的激活,为临床治疗骨溶解疾病提供了纳米材料治疗方案。结论:N-CDs有效地消除了RANKL诱导的ROS生成,削弱了ROS下游NF-κB和MAPK信号通路的激活,从而抑制破骨细胞的形成和活化,N-CDs可保护小鼠免受脂多糖（LPS）诱导的颅骨骨破坏和乳腺癌细胞诱导的胫骨骨溶解。