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目的和背景:关节软骨是透明软骨,缺乏血管、淋巴管和神经,仅依靠关节滑液的渗透提供营养,其损伤后的自愈能力非常有限。关节软骨损伤若不及时治疗,极易引发骨性关节炎（Osteoarthritis,OA）。OA不仅严重危害人类的身心健康,还给社会和家庭带来沉重的经济负担。遗憾的是,无论是药物治疗还是传统的外科手术治疗均难以再生透明软骨。随着研究人员对干细胞探索的逐渐深入,间充质干细胞（Mesenchymal stem cells,MSCs）治疗已经显示出再生关节软骨的潜力,基于MSCs的组织工程软骨取得了令人鼓舞的结果。MSCs具有强大的自我更新能力和向骨、软骨及脂肪分化的潜能,并且来源广泛,是较为理想的组织工程种子细胞。已有大量研究通过将MSCs与不同形式的组织工程支架相结合或单纯将MSCs注射入关节腔,促进了关节软骨或骨软骨的再生修复。但是,MSCs的致瘤风险、疾病传播风险、细胞储存和运输的较高标准以及相关监管政策对干细胞移植的严格要求限制了基于MSCs的组织工程软骨的进一步发展。所以,目前临床急需一种既能发挥MSCs功能又尽可能避免MSCs局限性的“无细胞”软骨再生方法。近年来,越来越多的研究显示,MSCs促进组织修复与再生的过程可能并非由MSCs直接分化导致,而是由其旁分泌的外泌体（Exosomes,Exos）介导。Exos是细胞间重要的通讯载体,内含多种蛋白质、核酸和脂质,具有与来源细胞相似的生物学功能。已有研究显示,MSC-Exos对关节软骨再生具有有益作用,并且可以抑制OA进展,但其具体机制尚不明确。另外,本课题组前期已成功制备了具有成分和结构双重仿生特性的脱细胞软骨细胞外基质（ACECM）垂直取向支架,动物实验显示该支架复合细胞后可以促进关节软骨再生。本研究的目的是构建基于人脐带华通胶间充质干细胞来源Exos（Human wharton’s jelly mesenchymal stem cell-derived exosomes,hWJMSC-Exos）和ACECM支架的“无细胞”组织工程软骨,探讨hWJMSC-Exos能否增强ACECM支架的修复效果,促进兔骨软骨再生。并且本研究创新性地从关节腔微环境角度初步探讨了hWJMSC-Exos促进骨软骨再生可能的机制,为“无细胞”组织工程软骨的构建和进一步推广提供了理论参考。研究方法:我们使用组织块贴壁法分离原代hWJMSCs,使用流式细胞术鉴定其标志物,通过三系诱导分化培养鉴定其向骨、软骨和脂肪分化的潜能。收集P3-P5代hWJMSCs的培养上清液,以差速超速离心法提取Exos。以透射电子显微镜（Transmission electron microscope,TEM）观察Exos的形态,以纳米粒子跟踪分析（Nanoparticle tracking analysis,NTA）检测Exos的粒径,以蛋白质印迹（Western blot,WB）法鉴定Exos的标志蛋白。以新鲜猪关节软骨制备ACECM支架,表征并验证其细胞相容性。分别通过细胞增殖实验、细胞迁移实验和RTPCR验证hWJMSC-Exos体外对骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchyml stem cells,BMSCs）和软骨细胞增殖、BMSCs迁移和巨噬细胞极化的影响。建立大鼠膝关节骨软骨缺损模型,以PBS关节腔内注射为对照组,hWJMSC-Exos关节腔内注射为实验组。通过对抗炎细胞因子IL-10和促炎细胞因子IL-1及TNF-α进行免疫组织化学染色,探讨hWJMSC-Exos对关节腔微环境炎症反应的影响。然后通过对总巨噬细胞标志物CD68、M1型巨噬细胞标志物CD86和M2型巨噬细胞标志物CD206进行免疫组织荧光染色评估hWJMSC-Exos体内对巨噬细胞极化的影响。通过对MSC标志物CD73和CD105进行免疫荧光染色评估hWJMSC-Exos体内对内源性干细胞迁移的影响。建立兔膝关节骨软骨缺损模型,以PBS关节腔内注射（PBS组）、PBS关节腔内注射联合ACECM支架植入（PBS+S组）、Exos关节腔内注射（Exo组）和不造成骨软骨缺损的假手术（Sham组）作为对照组,以Exos关节腔内注射联合ACECM支架植入（Exo+S组）作为实验组修复兔膝关节骨软骨缺损。术后当天和术后每7天重复进行关节腔注射PBS或hWJMSC-Exos,持续4周。在术后3个月和6个月分别处死一半数量的兔子,收集膝关节标本。通过宏观表现、影像学表现、组织形态学表现、生物力学和生物化学检测评价hWJMSC-Exos在兔膝关节骨软骨缺损模型中能否增强ACECM支架的修复效果,促进骨软骨再生。最后通过miRNA测序和通路富集分析初步探索hWJMSC-Exos在骨软骨再生中可能发挥作用的miRNA及其机制。结果:（1）hWJMSC-Exos具有Exo典型的形态特征并表达Exo的标志蛋白,符合Exo的标准。（2）ACECM支架横截面具有疏松多孔结构,纵截面具有类似天然软骨细胞的垂直取向结构,并具有良好的细胞相容性。（3）hWJMSC-Exos在体外可以促进BMSCs和软骨细胞增殖。（4）hWJMSC-Exos在体外可以促进BMSCs迁移,且这种作用呈剂量依赖性。（5）hWJMSC-Exos在体外可以促进巨噬细胞向M2型极化。（6）hWJMSC-Exos在体内可以促进巨噬细胞向M2型极化,进而促进抗炎细胞因子IL-10的升高,抑制关节腔微环境的炎症反应。（7）hWJMSC-Exos在体内可能在一定程度上促进内源性干细胞迁移,但相对于对照组（PBS）,这种作用并不显著。（8）hWJMSC-Exos可以增强ACECM支架的修复效果,Exo+S组新生软骨具有比较典型的透明软骨特征。（9）hWJMSC-Exos含有多种已被证实了可以促进骨软骨再生的miRNAs,通过筛选确定出20个可能在骨软骨再生中发挥作用的miRNAs。结论:hWJMSC-Exos可以增强ACECM支架修复骨软骨缺损的能力,其机制可能为通过对MSCs、软骨细胞和巨噬细胞生物行为的影响,调节关节腔微环境,促进骨软骨再生。基于hWJMSC-Exos和ACECM支架的“无细胞”组织工程策略有望成为促进骨软骨再生的有效途径。