论文部分内容阅读
目的:作用于雌激素受体（Estrogen Receptor,ER）的乳腺癌内分泌治疗为患者带来诸多临床获益,与ER相似,雄激素受体（Androgen Receptor,AR）也是类固醇受体超家族的一员,在乳腺癌中阳性率高达60%到80%。AR由N-末端激活域、DNA结合结构域、铰链区以及C-端配体结合结构域组成。与雄激素结合后AR入核与雄激素反应原件（androgen response elements,AREs）结合,同时招募辅调节因子,调控AR下游靶基因的转录,有关辅调节因子和转录调控过程中的表观遗传机制的改变引起了越来越多的关注。ER阴性的乳腺癌无法从内分泌治疗中获益,AR和参与调控AR信号通路的辅调节因子可能成为其治疗中有潜能的药物靶点。MDA-MB-453细胞系是一种广泛应用的ER阴性乳腺癌研究的细胞系,有研究表明雄激素能够刺激此细胞增殖,而AR拮抗剂抑制此细胞增殖,因此有人猜想在ER阴性的乳腺癌中,AR以一种独立于ER的方式驱动基因转录。BPTF相关蛋白（BPTF associated protein,BAP18）存在于MLL1-WDR5复合物和NURF/BPTF复合物中,包含一个SANT功能域,该功能域携带多种染色质重塑因子。有研究表明BAP18是AR重要的辅激活因子,能够上调AR介导的基因转录,促进了前列腺癌和去势抵抗前列腺癌细胞的增殖。在ER阳性的乳腺癌中,BAP18与COMPASS复合物共同招募在ER下游的靶基因上,促进靶基因的转录。然而,BAP18在ER阴性的乳腺癌中的作用仍有待研究。组蛋白高度乙酰化能够促进基因转录,反之组蛋白去乙酰化修饰抑制基因转录。SIN3A/HDAC复合物是一种多蛋白复合物,其中SIN3A是一种骨架蛋白,能够招募HDAC1/2、SAP30、SAP130等共同作用于靶基因的启动子区,该复合物主要通过去乙酰化酶活性介导抑制转录。有研究表明SIN3A/HDAC复合物能够抑制ER阳性的乳腺癌中介导细胞凋亡的重要基因的转录进而影响细胞的增殖,但SIN3A/HDAC复合物在ER阴性乳腺癌中的作用尚未见报道。在本研究中,我们的目的旨在（1）明确BAP18在ER阴性乳腺癌组织中的表达水平;（2）阐明BAP18参与AR介导的调控作用及其分子生物学机制;（3）解析BAP18的生物学功能,为ER阴性乳腺癌的治疗寻找新靶点。研究方法:1.本课题首先选取了20例未经过术前治疗的AR阳性的ER阴性乳腺癌患者,通过Western blot法分析了其组织中BAP18的水平,然后通过免疫组化法（immunohistochemistry,IHC）检测了乳腺癌组织中BAP18的表达水平,采用Kaplan-Meier plotter法分析了BAP18表达对患者预后的影响,明确BAP18表达与临床病理因素之间的关系及影响患者预后的因素。2.通过蛋白质免疫共沉淀实验（Co-IP）确定在ER阴性乳腺癌细胞中BAP18与AR之间是否相互结合;接下来利用荧光共聚焦显微镜扫描技术探索BAP18和AR在细胞中的定位,加入雄激素刺激后能否共定位;提取带有GFP标签的BAP18表达质粒,转入细胞后再次利用荧光共聚焦显微镜扫描技术明确BAP18和AR的位置。3.利用多种报告基因通过双荧光素酶报告基因实验检测在不同的ER阴性乳腺癌细胞系中BAP18对AR介导基因转录的调控作用,并检测了其对ARAF-1和ARAF-2的调控作用。4.采用Western blot法和Real-time PCR法检测敲减BAP18后AR下游靶基因的表达水平,验证AR下游靶基因的变化趋势与双报告结果是否一致。5.为了深入探索BAP18调控AR介导的基因转录的相关机制,接下来进行了Co-IP实验来确定BAP18和AR与SIN3A-HDAC1复合物成员之间是否存在相互作用,并通过双荧光素酶报告基因实验确定HDAC1及其抑制剂TSA是否影响BAP18对AR介导的基因转录的调控。6.利用染色质免疫共沉淀实验（Ch IP）实验检测BAP18对AR靶基因AREs区募集SIN3A-HDAC1复合物和组蛋白修饰的影响。7.通过细胞克隆形成实验及MTS实验检测敲减BAP18后细胞增殖的变化;通过流式细胞术检测敲减BAP18对细胞周期的影响。8.利用荷瘤小鼠检测BAP18在体内对ER阴性乳腺癌细胞成瘤及肿瘤生长的影响。结果:1.western blot实验结果显示在ER阴性乳腺癌患者中BAP18蛋白表达量显著高于癌旁正常组织,IHC检测的96例ER阴性乳腺癌组织和56例癌旁正常组织结果与其一致,Kaplan-Meier plotter法分析结果显示BAP18高表达与患者的不良预后相关。进一步分析BAP18与临床病理因素之间的关系,结果显示肿物越大、临床分期越高的患者BAP18表达水平越高,而患者的年龄、淋巴结转移状态、组织学分级和ki-67无显著差异,提示BAP18可能促进乳腺癌的发生发展,发挥促癌作用。此外,我们分析了影响这部分患者预后的独立影响因素,结果显示肿物大小、组织学分级和BAP18表达水平是影响患者预后的独立因素。2.Co-IP实验显示在经典的AR阳性的ER阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-453中,BAP18与AR存在相互作用,且雄激素刺激后作用增强。另一株ER阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231进行了外源性Co-IP检测,结果也同样印证了这一点。荧光共聚焦显微镜实验显示在MDA-MB-453细胞中,在雄激素刺激的环境下,无论内源性BAP18还是外源性BAP18均与AR共定位于细胞核中。3.荧光素酶双报告基因实验显示,BAP18能够抑制AR介导的基因转录,能够显著下调位于C端的配体依赖功能区介导的基因转录。4.Real-time RCR结果显示,在雄激素刺激的环境下,与对照组相比敲减BAP18组中P21、PTEN、KLLN、EAF2、PISD、KIBRA、MYC的m RNA水平均显著升高,Western blot同样发现敲减BAP18后AR下游靶基因的蛋白水平升高。5.Co-IP实验结果显示,在MDA-MB-453细胞中,BAP18和AR均能与SIN3A-HDAC1复合物的成员SAP130、HDAC1和SIN3A相结合。荧光素酶双报告基因实验显示,BAP18抑制AR介导的基因转录活性的程度与HDAC1呈剂量依赖关系,且加入HDAC1抑制剂TSA后抑制作用显著恢复。6.Ch IP实验显示在AR靶基因P21的启动子区有AR、BAP18、SAP130、HDAC1和SIN3A招募,并且在雄激素刺激时敲低BAP18后其招募量减少,该区域组蛋白H3和H4的乙酰化水平显著升高。7.克隆形成实验发现敲减BAP18后细胞增殖能力受到抑制,同样MTS实验结果发现敲减BAP18后细胞的增殖能力减弱。流式细胞术检测结果显示敲低BAP18后阻滞在G1期的细胞增多。8.荷瘤小鼠实验结果显示敲低BAP18能够减弱体内对ER阴性乳腺癌细胞成瘤能力。结论:1.ER阴性乳腺癌中BAP18高表达,与患者的临床分期和预后显著相关。2.ER阴性乳腺癌中BAP18与AR共定位于细胞核中且相互作用,抑制AR介导的基因转录。3.BAP18能够结合SIN3A-HDAC1复合物共同招募到AR靶基因的ARE上,同时催化组蛋白H3和H4的去乙酰化修饰。4.BAP18能够促进AR阳性的ER阴性乳腺癌细胞的生长。