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目的:肾间质纤维化（Renal interstitial fibrosis,RIF）是大部分慢性肾脏病（Chronic kidney disease,CKD）进展到终末期肾衰竭的必经途径,大量的临床和实验研究表明,RIF损害程度与CKD患者的肾功能损害程度明显相关,作为反映肾功能下降严重程度和判断患者预后的重要指标。因此,确定参与肾间质纤维化发病机制的关键分子机制将为治疗CKD患者提供新的治疗策略。以往研究表明,肾小管上皮细胞-间质转分化（Epithelial to mesenchymal transition,EMT）是导致肾间质纤维化的重要因素之一。在成熟组织的上皮中也可能经历EMT,如炎症和损伤,进而导致纤维发生。EMT可由各种条件引起,包括体外刺激转化生长因子-β1（Transforming growth factor-β1,TGF-β1）、动物肾脏纤维化模型和人阻塞性肾病。泛素化是蛋白质翻译后修饰的一种方式,泛素结合酶（E2）作为催化这一过程的关键角色之一,参与到细胞增殖、分化和迁移中来。泛素结合酶E2S（UBE2S,又称E2-EPF）是E2蛋白家族重要成员之一,可以调节DNA损伤诱导的转录沉默,并通过调控细胞周期和分化,促进肿瘤细胞的EMT过程,进而参与肿瘤的发生。然而,UBE2S在肾间质纤维化疾病及肾小管EMT中的作用仍是未知。本课题首先通过体内实验构建单侧输尿管梗阻（UUO）模型,探讨UBE2S与EMT参与的肾间质纤维化的关系,并应用抗纤维化药物吡非尼酮（Pirfenidone,PFD）治疗干预,探讨UBE2S在大鼠肾脏纤维化中的作用。体外实验通过转化生长因子-β1（TGF-β1）诱导人近端肾小管上皮细胞（HK-2细胞）发生EMT,探讨UBE2S与TGF-β1诱导的肾小管EMT的关系,最后深入研究UBE2S影响TGF-β1诱导肾小管发生EMT可能的分子机制。研究方法:体内实验:8—10周龄SD雄性大鼠（SPF级）共48只,体重280—320g。随机分为8组（n=6）:假手术组（SHAM）,手术3天组（UUO3）,手术7天组（UUO7）,手术14天组（UUO14）,用药3天组（PFD3）,用药7天组（PFD7）,安慰剂3天组（-PFD3）,安慰剂7天组（-PFD7）。按分组于第3、7和14天处死大鼠并取结扎侧肾脏。给药组和安慰剂组分别于术后1天开始给予PFD（500mg/kg/d）和生理盐水（500mg/kg/d）连续给予3天或7天后终止。采用HE和Masson染色法观察和评估各组大鼠肾脏的组织形态学改变,采用免疫组化法检测各组大鼠肾脏组织UBE2S、α-SMA、vimentin的表达,并用western blot及q RT-PCR检测各组大鼠肾脏组织UBE2S、HIF-1α、α-SMA、vimentin的表达。体外实验:用5ng/ml TGF-β1刺激HK-2细胞,观察细胞形态变化;通过western blot及q RT-PCR检测UBE2S、HIF-1α、α-SMA、vimentin的表达;分别构建UBE2S shRNA慢病毒载体及UBE2S过表达慢病毒载体,转染HK-2细胞,检测TGF-β1刺激下UBE2S、α-SMA、vimentin的表达,并通过transwell实验研究对细胞迁移能力的影响。通过过表达和敲低UBE2S探讨TGF-β1刺激下EMT中HIF-1α的表达,深入研究UBE2S影响TGF-β1诱导的EMT的机制。结果:1.成功建立UUO大鼠模型:HE染色中UUO组肾小管显著扩张,上皮细胞坏死脱落,随着梗阻时间延长肾小管损伤明显;Masson染色中UUO7、UUO14组可见大量蓝染的纤维化病变;EMT标志蛋白α-SMA和vimentin在UUO组中显著增高,且随着梗阻时间延长有增高的趋势;western blot中UBE2S在UUO组中表达增高,且在UUO3和UUO7天达高峰;HIF-1α在UUO组中均表达增高明显;PFD干预后,给药组的UBE2S、HIF-1α及EMT指标α-SMA、vimentin表达水平明显低于安慰剂组。2.慢病毒过表达UBE2S转染HK-2细胞后用5ng/ml TGF-β1刺激24h,α-SMA和vimentin的表达相对于对照组显著增高;且过表达UBE2S增加TGF-β1刺激下细胞迁移能力。慢病毒sh UBE2S转染HK-2细胞后用5ng/ml TGF-β1刺激24h,α-SMA和vimentin的表达相对于对照组显著降低。3.在TGF-β1诱导下,UBE2S过表达上调HIF-1α;敲低UBE2S下调HIF-1α,且VHL在m RNA水平升高。结论:1.UBE2S参与大鼠UUO模型诱导的肾脏纤维化中,且可能与HIF-1α共同调节EMT;PFD抗纤维化药物可能通过抑制UBE2S缓解EMT引起的肾脏纤维化作用;2.UBE2S可促进TGF-β1诱导的HK-2细胞发生EMT;3.UBE2S通过上调HIF-1α从而促进TGF-β1诱导HK-2细胞发生EMT。