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水稻突变体的筛选是研究水稻生长发育调控过程和分子调控机制的重要手段,利用图位克隆的方法克隆水稻突变体基因并分析其功能对解析水稻生理代谢途径,鉴定参与这些途径的新的关键因子具有重要意义。本研究是在汪鹏(2015)研究结果的基础上对水稻dull突变体w54突变基因的进一步定位和图位克隆,同时分析了 w54中淀粉代谢相关基因的表达水平和关键酶类的活性。此外,从粳稻越光(Koshihikari)化学诱变的M2群体中分离到一个温度敏感型黄叶突变体y12(t),分析了其表型,并对突变基因进行了定位。主要结果如下:1.w54种子的胚乳呈现半不透明(dull),直链淀粉含量显著降低。半薄切片观察表明,与野生型相比,w54胚乳中复合型淀粉颗粒发育正常,但Ⅰ2-KI染色较浅。2.种子灌浆期间贮藏物质积累曲线表明,除开花后15天(days after fertilization,DAF),在测定的各时期,w54胚乳中贮藏物质的积累量较野生型显著低。同时期,w54种子中直链淀粉的积累与野生型相比显著缓慢。3.前期已将w54突变基因定位在水稻第6染色体长臂的280kb区间内;在此基础上,增加定位极端个体至900个、加密分子标记,最终将w54突变基因定位于第6染色体标记W72和W47之间约187kb的区间内,该区间内预测有26个ORF,在第23个基因的第八外显子上发现一个C到T的突变,导致蛋白质翻译提前终止。4.qRT-PCR实验发现,与野生型相比,6和9DAF的w54胚乳中Wxb基因的表达水平显著降低,在9天时仅为野生型的十分之一,但12天时恢复至野生型水平。Wxb基因pre-mRNA剪接的半定量测定表明,12DAF的w54胚乳中Wxb基因异常剪接的产物增多。5.qRT-PCR结果表明,与野生型相比,在w54的12DAF胚乳中控制淀粉合成基因淀粉分支酶Ⅱla、蔗糖合酶和淀粉合酶IVb的表达水平显著降低,其他基因表达量的变化较小。6.Western blotting分析表明,在12DAF的w54和野生型胚乳中,淀粉合成相关酶中磷酸烯醇式丙酮酸双激酶、ADPG焦磷酸化酶大亚基2、ADPG焦磷酸化酶小亚基2b、质体磷酸化酶1、淀粉分支酶Ⅰ和淀粉合酶Ⅱa的蛋白含量均未发现显著差异。7.活性电泳表明,与野生型相比,w54的12DAF的胚乳中淀粉合成关键酶类如异淀粉酶和普鲁兰酶、可溶性淀粉合酶Ⅰ以及质体磷酸化酶的酶活均没有显著差异,而可溶性淀粉合酶Ⅲa的活性略微升高。综上所述,w54胚乳中Wxb基因的表达水平较野生型显著下调,并且Wxb基因的mRNA异常剪接量增加,推测W54蛋白可能通过调控Wxb基因的转录或者转录后调控参与直链淀粉的合成。8.水稻黄叶突变体y12(t)经20℃持续处理15天时幼苗表现为黄叶,幼苗叶片中叶绿素含量较野生型显著降低,但叶绿体发育未受到明显影响;若处理时间延长至20天,y12(t)幼苗则不能继续生长最后死亡,转移至或在30℃连续生长时叶色正常。田间生长条件下,y12(t)的农艺性状与野生型相比,没有显著差异。qRT-PCR结果表明,20℃和30℃两种温度条件下,与野生型相比,y12(t)幼苗中叶绿素合成相关基因的表达出现不同的变化。遗传分析表明,y12(t)突变表型受一对隐性核基因控制,该基因被定位在第8染色体长臂末端标记N8-36与P16之间647kb范围内,是一个新的控制水稻叶绿素合成的基因。