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在中国,肺癌是死亡率最高的恶性肿瘤,其中,非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)约占85%.NSCLC病程进展快,易复发和转移,预后极差.随着肿瘤分子基础研究的快速发展,研究人员发现NSCLC系一种基因驱动的异质性疾病,多基因参与其发生和发展,并通过相关信号通路调节NSCLC的恶性生物学行为.因此,针对特定基因的分子靶向治疗日益凸显其重要的临床地位. 同源异型盒(homeobox,HOX)基因在生物发育过程中起着重要的调控作用.近年来研究表明,HOX基因的异常表达与肿瘤的发生和发展密切相关,不仅影响肿瘤细胞的增殖、凋亡和血管生成,还参与肿瘤的耐药过程.HOXC6是HOX家族中的重要成员之一,被证实在乳腺癌、胃癌、结肠癌、肝癌和前列腺癌等多种癌症中异常表达.然而,肺癌中少有HOXC6基因的研究,HOXC6是否参与NSCLC的发生和发展,其在NSCLC中的作用尚不清楚. 本课题组前期通过对NSCLC吉非替尼(gefitinib,Gef)敏感PC9细胞和耐药PC9/G细胞基因表达谱的比较分析,发现PC9/G细胞中HOXC6明显上调.同时证实,HOXC6基因在NSCLC组织中高表达,且与淋巴结侵袭及TNM临床分期显著相关,并影响患者的总生存期,提示HOXC6可能作为促癌基因,参与NSCLC的发生和发展.并在HOXC6高表达的PC9/G细胞中采用siRNA沉默HOXC6的实验方法,探讨HOXC6与Gef敏感性的关系.在前期工作的基础上,本课题拟以HOXC6低表达的PC9细胞作为研究对象,采用瞬时转染质粒的方法,建立HOXC6过表达转染细胞株,检测PC9细胞的恶性生物学行为变化,进一步探究HOXC6在NSCLC发生和发展中的作用以及对Gef敏感性的影响和机制,以期为NSCLC的分子靶向治疗提供新的思路.本研究分为以下二个部分: 第一部分:HOXC6过表达对NSCLC细胞生物学行为和药物敏感性的影响 目的:探讨HOXC6过表达对PC9细胞增殖、细胞凋亡、细胞周期、迁移和侵袭以及对Gef敏感性的影响. 方法:1)在PC9细胞中,转染阴性对照质粒pcDNA3.1-NC或过表达质粒pcDNA3.1-HOXC6,建立HOXC6过表达转染细胞株,Western blot检测HOXC6蛋白的表达变化;2)HOXC6过表达后,CCK-8法检测PC9细胞对Gef敏感性的变化;3)HOXC6过表达后,克隆形成实验检测PC9细胞增殖能力的变化,以及Gef对PC9细胞增殖能力的影响;4)HOXC6过表达后,流式细胞术检测PC9细胞凋亡和细胞周期的变化,以及Gef对PC9细胞凋亡和细胞周期的影响;5)HOXC6过表达后,Transwell检测PC9细胞迁移和侵袭能力的变化,以及Gef对PC9细胞迁移和侵袭能力的影响. 结果:1)PC9细胞转染质粒pcDNA3.1-HOXC6后,HOXC6蛋白表达显著增加(P<0.01),成功构建HOXC6过表达的转染细胞株;2)CCK-8实验结果表明,HOXC6过表达后,PC9细胞对Gef的敏感性降低(P<0.05);3)HOXC6过表达后,PC9细胞增殖能力显著增强(P<0.01),并且Gef对PC9细胞增殖的抑制作用明显减弱(P<0.01);4)HOXC6过表达后,细胞凋亡减少(P<0.01),G0/G1期细胞比例升高(P<0.05),S期比例降低(P<0.05),G2/M期比例降低(P<0.01),且Gef诱导的细胞凋亡减少(P<0.05),G2/M期阻滞作用减弱(P<0.05);5)HOXC6过表达后,PC9细胞迁移和侵袭能力显著增强(P<0.001,P<0.001),且Gef对PC9细胞迁移和侵袭能力的抑制作用显著减弱(P<0.01,P<0.001). 结论:过表达HOXC6可促进细胞增殖,抑制细胞凋亡,调节细胞周期,增强细胞迁移和侵袭能力,并降低NSCLC细胞对Gef的敏感性.本部分研究发现HOXC6在NSCLC中的促癌作用,HOXC6可能成为肺癌的潜在治疗靶点. 第二部分:HOXC6调节NSCLC细胞增殖、凋亡、侵袭转移和药物敏感性的分子机制 目的:探讨HOXC6促进PC9细胞增殖、抑制细胞凋亡、增强侵袭转移能力以及影响Gef敏感性的分子机制. 方法:1)在PC9细胞中,转染阴性对照质粒pcDNA3.1-NC或过表达质粒pcDNA3.1-HOXC6,建立HOXC6过表达转染细胞株;2)Western blot检测相关蛋白的表达:存活蛋白Survivin和抗凋亡蛋白Bcl-2、促凋亡蛋白Bim;细胞周期蛋白Cyclin B1和Cyclin D1;侵袭转移相关蛋白Akt、GSK3β、β-catenin和MMP-9;ABC转运体家族蛋白ABCG2,MDR1和MRP1. 结果:与PC9细胞和PC9+pcDNA3.1-NC细胞相比,PC9+pcDNA3.1-HOXC6细胞内,存活蛋白Survivin和抗凋亡蛋白Bcl-2表达增加(P<0.01,P<0.05),促凋亡蛋白Bim表达显著降低(P<0.001);细胞周期蛋白Cyclin B1表达降低(P<0.01),而Cyclin D1表达升高(P<0.01);侵袭转移相关蛋白Akt、β-catenin和MMP-9表达显著增加(P<0.01,P<0.001,P<0.01),GSK3β表达显著减少(P<0.01);ABC转运蛋白ABCG2,MDR1和MRP1表达均显著升高(P<0.05,P<0.01,P<0.01). 结论:HOXC6过表达可能通过上调存活蛋白Survivin和抗凋亡蛋白Bcl-2,下调促凋亡蛋白Bim抑制细胞凋亡;下调Cyclin B1和上调Cyclin D1,调节细胞周期;调节Akt/GSK3β/β-catenin信号通路,促进MMP-9的表达而增强细胞侵袭转移能力;促进ABC转运体家族蛋白ABCG2,MDR1和MRP1的表达,增加药物的外排和减少蓄积,降低PC9细胞对Gef的敏感性.本部分研究丰富了HOXC6的调节网络,为阐释其在NSCLC中的作用提供了实验依据.