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目的雌激素在中枢神经系统中不仅作用于脑内与生殖相关的神经回路影响体内性激素的周期,还作用于与认知功能相关的神经回路(海马回路)影响学习和记忆。海马是与学习记忆、情绪及行为等多种功能有关的重要脑区,而雌激素受体α和β在海马中均有分布,因此海马也是雌激素作用的主要靶点之一。很多动物实验研究已证明雌激素具有“保护神经”、促进学习记忆的作用,但其作用的分子机制非常复杂。研究表明,女性绝经后若给予雌激素替代治疗(Estrogen replacement therapy,ERT)可明显延缓及改善学习记忆功能障碍,但ERT会增加乳腺癌及子宫内膜癌发生的危险性,因此寻找一种既能预防绝经后记忆功能下降又能避免这些严重副作用的替代药物势在必行。中医理论认为“肾主骨生髓”、“脑为髓海”,肾之精气亏损,脑之髓海失充为导致记忆障碍的关键。因此,补肾、固精的中药应该都有改善学习记忆功能的作用。制首乌味甘、涩、微温,归肝、肾经,有补益精血,益肝补肾之功效。何首乌的药理作用十分广泛,除具有降血脂、抗动脉硬化、增强免疫功能、抗衰老等作用外,还具有益智作用。但其益智的药理机制尚不清楚。胞外信号调节激酶1/2 (Extracellular regulated protein kinase 1/2,ERK 1/2)信号通路属于进化保守的丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinases,MAPK)信号转导系统,也是该系统最为重要的信号转导通路之一。近年来的研究证实,ERK 1/2信号通路的激活参与了脑内长时程增强(Long-term potentiation,LTP)以及学习和记忆的形成。其激活最终表现为ERK1/2的大量磷酸化(p-ERK 1/2),并激活多种下游底物,将胞外信号传导至胞核。Raf激酶抑制蛋白(Raf kinase inhibitor protein,RKIP)是MAPK信号转导通路的内源性抑制剂。其调节机制主要是和Raf-1激酶区域相互作用,最终抑制ERK 1/2的磷酸化,影响MAPK- ERK 1/2通路的活化。在离体神经元细胞培养中显示,雌激素可通过非经典信号途径引起ERK1/2磷酸化,但是在整体动物实验条件下,缺乏雌激素是否引起这条通路的状态发生变化以及与这条通路相关的蛋白——RKIP的表达改变,国内外还尚无报道。本实验的目的是以去卵巢大鼠为研究对象,观察雌激素缺乏对学习记忆能力的影响,及对海马信号通路中ERK1/2通路活性和RKIP表达的影响,探讨它们之间的相互关系,同时观察何首乌的干预作用。方法1实验动物分组将4月龄雌性SD大鼠30只随机分为3组:假手术组(Sham组)、去卵巢组(OVX组)和去卵巢给予何首乌组(OVX+HE组),每组10只。Sham组为双侧去除少量卵巢上脂肪组织;OVX组为去除双侧卵巢;OVX+HE组为去卵巢手术2周后给予何首乌水煎剂喂服,2g/kg.d。手术后常规喂养4个月后处死,于处死前4天进行行为学训练及测试。2行为学测试于动物处死前4天启用Morris水迷宫测试大鼠空间学习记忆能力。前三天为适应性训练,随后将每组大鼠随机分为训练组(5只)和非训练组(5只)。于第4天进行正式的行为学测试,训练组大鼠采用连续6次的潜台试验,以最后3次逃避潜伏期(Escape latency)的平均值作为评价大鼠空间学习记忆能力的指标。非训练组大鼠只在无平台水池中进行1分钟的游泳。3组织标本的获取及指标测定行为训练完成后立即处死大鼠,迅速分离海马背侧组织置于液氮中,于-70℃低温冰箱保存,用于组织蛋白的提取。3.1蛋白提取及定量提取海马背侧组织蛋白并用Bradford法测定蛋白含量。以每毫升样品中的毫克蛋白量(mg/ml)表示。3.2目的蛋白的测定ERK1/2和β-actin分别作为p-ERK1/2和RKIP的内参照,用western-blotting法测定大鼠海马p-ERK1/2和RKIP蛋白的相对含量。结果1大鼠空间学习记忆能力的变化各训练组大鼠逃避潜伏期随训练次数增加而缩短,取最后三次逃避潜伏期的平均值进行观察,OVX组逃避潜伏期(26.798±6.215)明显长于Sham组(15.726±4.001) (P<0.05),提示雌激素缺乏会引起大鼠学习记忆能力下降;OVX+HE组逃避潜伏期(17.972±7.558)与Sham组(15.726±4.001)之间无差别(P>0.05),提示何首乌能改善雌激素缺乏对大鼠学习记忆能力的损伤。2大鼠海马ERK1/2通路活性的变化2.1 Sham、OVX和OVX+HE各组的训练组大鼠p-ERK1/2蛋白相对含量(Sham 0.696±0.074;OVX 0.442±0.054;OVX+HE 0.502±0.061)比非训练组大鼠(Sham 0.51±0.091 ; OVX 0.285±0.081;OVX+HE 0.394±0.067)明显升高(P<0.05),说明在进行学习记忆能力训练的过程中ERK1/2的磷酸化增多,提示海马CA1/CA2区ERK1/2信号通路的活化参与了空间学习记忆的形成。2.2对各组的非训练大鼠进行比较,OVX组的p-ERK1/2蛋白相对含量(0.285±0.081)比Sham组(0.51±0.091)明显降低(P<0.05),说明去卵巢后雌激素缺乏会使ERK1/2通路的基础活性下降。同时,对各训练组大鼠进行比较,OVX组的p-ERK1/2蛋白相对含量(0.442±0.054)比Sham组(0.696±0.074)明显降低(P<0.05),说明去卵巢后雌激素缺乏也使由学习记忆训练诱导的ERK1/2通路的诱发活性下降,提示雌激素可能直接或间接的影响了ERK1/2通路的活性。而OVX+HE组与OVX组之间非训练大鼠和训练大鼠的p-ERK1/2蛋白相对含量均无差别,说明何首乌并不影响ERK1/2通路的活性,提示何首乌对雌激素缺乏大鼠学习记忆能力的改善并不是通过ERK1/2通路来发挥作用的。3大鼠海马RKIP蛋白表达水平的变化与Sham组(0.461±0.067)比较,OVX组RKIP蛋白的相对表达量(0.702±0.084)明显升高(P<0.05),说明去卵巢后雌激素缺乏导致了RKIP蛋白水平的升高,这提示雌激素可能直接或间接的调节海马CA1/CA2区RKIP的表达。而OVX+HE组(0.662±0.078)与OVX组(0.702±0.084)之间无差别(P>0.05),说明何首乌不影响这种由于去卵巢后雌激素缺乏而导致的RKIP的表达。结论1大鼠去卵巢后雌激素缺乏可引起空间学习记忆能力下降。2大鼠海马CA1/CA2区ERK1/2的基础磷酸化程度较低,经学习记忆训练诱发的p-ERK1/2水平也较低,而该通路的抑制蛋白——RKIP表达是增加的,这两个方面的影响是支撑雌激素缺乏大鼠空间学习记忆能力下降的分子机制之一。3何首乌可以改善去卵巢大鼠空间学习记忆能力的衰退,但其不影响ERK1/2的基础磷酸化和诱发磷酸化,也不影响RKIP蛋白表达水平,说明何首乌对空间学习记忆能力的影响并不是通过ERK1/2信号通路来起作用的。