【摘 要】
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草鱼是世界上产量最高的淡水鱼种之一,其工业化处理的过程中会产生大量的鱼鳞废弃物,而鱼鳞是一种蛋白质含量丰富的原料,也是抗氧化肽的理想来源。鱼鳞经过蛋白酶的辅助水解与分离纯化操作后,可以得到经济价值很高的抗氧化肽,并应用到市场中。论文选用一种Bacillus altitudinis W3来源的微生物碱性蛋白酶BaApr1来水解草鱼鱼鳞,通过优化水解过程,得到了高抗氧化活性的鱼鳞水解产物,然后通过一系
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草鱼是世界上产量最高的淡水鱼种之一,其工业化处理的过程中会产生大量的鱼鳞废弃物,而鱼鳞是一种蛋白质含量丰富的原料,也是抗氧化肽的理想来源。鱼鳞经过蛋白酶的辅助水解与分离纯化操作后,可以得到经济价值很高的抗氧化肽,并应用到市场中。论文选用一种Bacillus altitudinis W3来源的微生物碱性蛋白酶BaApr1来水解草鱼鱼鳞,通过优化水解过程,得到了高抗氧化活性的鱼鳞水解产物,然后通过一系列分离纯化技术从中得到三种新型抗氧化肽,并对其体外活性进行了评估。论文的主要研究成果如下:（1）表达后的BaApr1粗酶液经过硫酸铵沉淀、镍柱亲和层析和脱盐后得到了纯酶,最终纯化倍数为30.06倍,回收率为30.44%。BaApr1的最适反应温度为50℃,最适反应p H为9.5,在中温和碱性条件下分别放置9 h后均能表现出良好的活性稳定性。金属离子中Ca2+对BaApr1的激活作用最明显,在5 mmol·L-1时可以增加到1.80倍。（2）在水解鱼鳞前,先对其进行脱钙处理,最佳脱钙条件为:盐酸浓度0.4 mol·L-1、料液比（m/v）1:15、脱钙时间120 min。脱钙后的鱼鳞经过八种蛋白酶的水解,其中BaApr1的水解产物相较于其它酶的产物表现出了最好的抗氧化活性。BaApr1水解鱼鳞的单因素优化结果为:最适酶添加量1250 U·g-1、最适水解时间7 h、最适温度50℃、最适p H 9.5。正交试验设计得到的最优条件为:酶添加量1250 U·g-1、水解时间7 h、温度50℃、p H 9.0。最优条件下制备得到了草鱼鱼鳞水解产物（GCSH）。（3）GCSH的蛋白质含量为88.15%,其总疏水氨基酸含量为28.27%,总必需氨基酸含量为19.51%,总鲜味氨基酸含量为60.54%,证明它具有很好的营养价值和应用价值。GCSH的溶解度在p H 3.0-11.0的范围内都能达到90%以上,在p H 6.0时达到最高值98.06%,另外GCSH对温度0-100℃、p H 2.0-12.0的条件以及胃肠道消化都有一定的耐受能力,能够保证抗氧化活性的稳定性,符合食品工业化应用的需求。（4）对GCSH进行分离纯化以提取得到高效的抗氧化肽,以各分离组分的DPPH·和ABTS+·清除能力作为指标。首先GCSH经过超滤得到组分UF-3（＜3 k Da）,然后经过阴离子交换色谱得到组分AEC-3(0.5 mol·L-1 Na Cl洗脱),再经过凝胶分离色谱得到组分GFC-1,最后经过超高效液相色谱分离得到肽组分SHP2、SHP4和SHP5。使用二级质谱鉴定得到三个肽的氨基酸序列分别为:Tyr-Val-Gln-Ala-Gly-Ala-Ala-Gly-Ala-Ala-Ala-His（SHP2）,Val-Lys-Leu-Tyr-Val-Leu-Leu-Val-Pro（SHP4）,和Val-Gln-Val-Leu-Al a-Gly-Pro-Val-Val-Lys-Leu-Tyr（SHP5）。（5）对SHP2、SHP4和SHP5进行活性评估,其清除DPPH·的半消除浓度(EC50)值分别为4.08 mg·m L-1、5.82 mg·m L-1和4.52 mg·m L-1;清除ABTS+·的EC50值分别为0.23 mg·m L-1、0.55 mg·m L-1和0.37 mg·m L-1;清除HO·的EC50值分别为2.78 mg·m L-1、3.70 mg·m L-1和3.16 mg·m L-1。SHP2不仅表现出最高的自由基清除能力,还表现出最强的还原能力,在5 mg·m L-1时达到了0.64。三种肽中,SHP5表现出最好的抑制脂质过氧化能力,能抑制7 d内79.81%的亚油酸脂质过氧化和15 d内33.23%的牛肉脂质过氧化。SHP2、SHP4和SHP5的抗氧化活性与其分子量范围（1043-1285 Da）和一级结构中存在的疏水性氨基酸（Ala、Val、Leu、Pro）、芳香族氨基酸（Tyr）、Gly和His等氨基酸有关。
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