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细菌可以采用各式各样的策略利用芳香化合物作为能源物质来生长,所有的这些代谢途径都是在调节因子调控基因表达水平的基础上实现的。Corynebacterium glutamicum是一种非致病的、需氧的革兰氏阳性细菌,它可以利用多种芳香化合物作为唯一碳源和能源生长。研究发现C.glutamicum可以通过基因ncgl2588(phe)来代谢苯酚,phe基因编码一种单组分双亚基苯酚羟化酶。首先苯酚羟化酶催化苯酚转变为邻苯二酚,然后邻苯二酚经由邻位开环途径,其代谢物进入三羧酸循环而被彻底分解。位于phe基因上游的基因ncgl2587(pheR)编码一个377个氨基酸的AraC/XylS型调节蛋白,采用一系列方法证明pheR激活苯酚羟化酶基因phe的表达。在C.glutamicum中呈现出较完整的苯酚初始代谢调节机制,更多有关C.glutamicum代谢芳香化合物的调节机制需要探究,这为强化C.glutamicum代谢芳香化合物的能力奠定基础。因此我们可采用更经济、高效的微生物代谢有毒化合物的方式来治理环境污染。1.利用重叠PCR的方法构建重组质粒pk18mobsacB-△pheR,然后通过同源重组的方法敲除Corynebacterium glutamicum基因pheR。将突变体△pheR和野生菌株C.glutamicum分别在含有3mM苯酚的无机盐培养基中培养,发现突变体△pheR失去了利用苯酚的能力。当互补基因phe R后,突变菌株恢复了代谢苯酚的能力,证明基因pheR对于C.glutamicum代谢苯酚是必须的。构建融合启动子pK18mobsacB-Pphe::lacZ,测定基因phe启动子酶活,结果说明在C.glutamicum中pheR对phe起正调节作用,有助于C.glutamicum更好代谢苯酚。同时RT-PCR的结果进一步证实pheR激活基因phe的表达。2.基因pheR克隆入表达载体pET21a,载体N端携带促融标签MBP,这样PheR蛋白是可溶的,可用常规纯化方法得到完整的PheR蛋白。凝胶迁移实验证明PheR蛋白直接结合在基因phe的启动子上发挥调节功能的。3.DNase I footprinting assay确定PheR在phe启动子上的结合位点。结合位点为TGTTCTCAGGCGGACATCATCTTGCCTAACACAGACAA。当替换掉结合位点后,PheR无法结合在phe启动子上。但是报告基因酶活显示基因phe存在微量表达。4.PheR蛋白与AraC/XylS型调节蛋白进行多序列比对,分析蛋白同源性和HTH结构域。PheR蛋白的第一个HTH结构位于蛋白质氨基酸序列的247-273,第二个HTH结构域预测位于氨基酸序列的288-328位置。