植物CNA类似物的探寻与PPKL家族新成员BSL4的初步鉴定

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本文一共分为两大部分,共九章内容(详见目录):第一部分植物中CNA类似物的生化鉴定和活性测定;第二部分拟南芥中PPKL家族新成员BSL4的初步鉴定。分述如下。   第一部分围绕植物中CNA类似物的探寻实验展开。采用了两种CN的常用底物pNPP和RII多肽进行测活实验,结果表明烟草的CaM亲合蛋白样品具有CNA的特征活性。它的蛋白磷酸酶活性明显受Ca2+/CaM的激活;同位素标记RII多肽底物脱磷酸化时CN专一性免疫抑制剂-CsA/CyP和FK506/FKBP发挥负调控。通过双向电泳耦联western的方法,从烟草CaM亲合蛋白样品中鉴定出了一个与CNA大小和等电点均类似的蛋白点,初步认定了它就是植物中潜在的CNA类似物。   第二部分是第一部分的延续,主要出发点依然是寻找植物中的CNA类似物,故事从我们偶然克隆到了一条新基因开始,经鉴定它是拟南芥中PPKL家族的一个新成员,我们将其命名为BSLA。我们对BSLA的初步鉴定,从序列信息,分子量,等电点分析,还包括亚细胞定位预测,二级和三级空间三维结构的预测等具体展开。在体外的蛋白磷酸酶测活实验中,采用蛋白磷酸酶的通用底物pNPP的测活结果表明,BSL4明显受到外源Mn2+的激活,激活倍数通常会达到上百倍,而且100uM Mn2+已经将BSL4活性激活至最高。BSL4的最适PH和最适盐离子强度分别是PH7.4和100mM盐离子浓度。相对BSL4,BSLA-C对Mn2+,Ca2+,Ca2++CaM,EGTA的表现极不明显,其相对活性远低于BSL4。BSLA对除Mn2+外的其他常见二价金属离子没有激活效应。为了更好的研究和跟踪BSL4,我们制备了优质的BSL4小鼠腹水多克隆抗体。通过酵母双杂交方法,筛选了拟南芥文库中能够与BSL4发生相互作用的潜在蛋白侯选者。最终获得了四个相互作用靶蛋白,分别是:RPP3B,丝氨酸蛋白酶抑制剂),CAB3和钙调素7。最后,做为一个小插曲,通过PCR鉴定的方法筛选了BSL4的插入缺失突变体植株并对突变体植株和野生型植株进行同等条件培养发现生长状况上存在极其明显的差异,暗示了BSL4在植物发育中的潜在功能。
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