止血是外科手术的基本操作，传统止血方法遇有不可控制的出血时效果欠佳。新型止血敷料是新近研发的一种局部快速止血材料，通过加强局部凝血因子浓度、血小板数量和质量、血管收缩功能等生理止血因素，并结合堵塞、压迫、热止血等传统方法，达到快速止血的目的，有些还具有多功能敷料的特性。它的应用使外科的这一止血现状大为改善。但是，现有新型止血敷料尚存在环境稳定性、副损伤、止血效果不确切、价格昂贵等多方面问题。 纳米止血材料是外科止血领域的最新发展。纳米材料有着独特的性质(如表面效应、尺寸效应、隧道效应等)，使之为外科止血提供了独立于缝扎、电凝、填塞、促进凝血栓形成等方法之外的新途径。但是纳米止血技术刚刚起步，有待完善。 酶固定化技术使提高现有止血剂的环境稳定性成为可能，特别是提高凝血酶等生物止血材料的稳定性，有着独特的优势。当前，已有固定化凝血酶的文献报道。纳米技术固定化酶可以有效减小空间效应、分配效应、扩散效应等多种效应对酶动力学的影响，最大限度提高酶活性收率，但尚未发现关于纳米技术固定化凝血酶的相关研究。 本论文着眼于手术和急救的止血需要，整合纳米技术、酶固定化技术于新型止血材料中，提出以下设想： 1．以天然止血材料壳聚糖为原材料，运用离子交联技术，制备纳米粒，实现止血材料的纳米化，从而改变壳聚糖的止血特性，同时进一步研究纳米止血材料的止血机理。 2．以壳聚糖纳米粒为载体，运用酶固定化技术，对凝血酶进行改性，提高其环境稳定性，拓宽其使用范围，为发展新一代纳米止血材料做基础研究。 第一部分：壳聚糖纳米微粒的制备及表征 研究内容： 本部分内容着眼于运用离子交联法制备合适的粒径较小的壳聚糖纳米粒固定化酶载体，以期减小固定化过程和固定化载体对酶动力学的影响，得到最大的酶活性收率，为下面的实验做基础研究。 结果： 在最佳条件下制得的纳米粒粒径最小，平均粒径为28.4nm，粒径分布较集中，可满足纳米粒固定化酶载体的要求。经TEM观察，粒子成球性好。红外光谱研究显示，壳聚糖分子的氨基与TPP的磷酸基之间有较强的静电结合作用。 结论： 以壳聚糖和三聚磷酸钠为载体材料，采用离子交联法制备CS-TPP纳米粒，该纳米微粒粒径小，成球性较好，可满足未来固定化凝血酶的要求。 第二部分：壳聚糖纳米粒固定化凝血酶的制备及性质 研究内容： 本部分集中研究壳聚糖固定化凝血酶(CS-TPP-TH纳米粒)的制备方法、影响因素，进而探讨CS-TPP-TH纳米粒的包封率、载药率以及其活性收率和环境稳定性。 结果： 凝血酶初始量影响到CS-TPP-Th纳米粒粒径，Th/CS=0.8时，CS-TPP-Th纳米粒粒径最小为35.3nm，同时还影响其包封率和载药率。CS-TPP-Th纳米粒的最适温度为40℃，最适pH值为6.9，37℃环境下活性收率为66.96﹪，半衰期为120h。 结论： CS-TPP纳米粒通过纳米粒包埋法、电荷吸附法固定化凝血酶，可以不改变凝血酶的结构；同时，纳米级的固定化载体，减小了空间效应、分配效应、扩散效应对固定化凝血酶的活性影响，因此，在大幅度提高固定化酶的稳定性的同时，保证了较大的酶活性收率。 第三部分：壳聚糖纳米粒固定化凝血酶的凝血功能检测和动物实验 研究内容： 本部分实验通过对CS-TPP-Th纳米粒的实验室检测，对其凝血功能及机理进行评估与研究，进而研究纳米止血材料的止血机理；最后制作多种动物出血模型，对CS-TPP-Th纳米粒冻干粉进行初步的应用研究。 结果： CS-TPP-Th纳米粒和壳聚糖对RBC聚集性的影响没有统计学意义(P>0.05)，前者可明显减少凝血时间(P<0.05)；动物实验中，CS-TPP-Th纳米粒冻干粉可以用于各种类型的出血创面，可明显缩短创面的即时止血时间、减少出血量(P<0.05)，降低再出血发生率和死亡率；组织学检查未发现明显的纤维组织增生，且部分纳米粒已经被吸收。 结论： CS-TPP-Th纳米粒通过纳米粒的表面效应、影响RBC聚集、凝血酶的直接作用，以及CS-TPP-Th纳米粒的黏附等多种机制加速创面止血，最终减少死亡率，并且组织相容性较好，无重大并发症发生。