目的:探讨皮肤组织体外消化培养的优化方案,分析不同体外消化培养方案对获取原代细胞的数量及活性的影响,并在动物模型中分析皮肤细胞活性对创面愈合的影响。方法:取人体皮肤组织,采用胶原酶+胰酶(A组)、单一胰酶(B组)、组织贴壁(C组)三种方法进行体外消化,并贴壁培养,通过以下方法评估不同组织消化方法对细胞获取数量及细胞活性的影响。评估方法:1)观察细胞从组织游离出的时间,第一次传代后细胞数量,绘制生长曲线;2)通过免疫荧光检测细胞Vimentin表达鉴定皮肤细胞的主体成份;3)采用CCK8法检测细胞活性,分析不同组织消化方法对细胞活性的影响;4)采用流式细胞术检测细胞表面标记物CD34、CD45、CD44的表达,以评估不同组织消化方法对皮肤细胞中干细胞比例及成纤维细胞老化的影响;5)建立nu/nu裸鼠局部急性创面模型,创面每天涂抹皮肤细胞、老化的皮肤细胞及生理盐水,通过对创面愈合时间、愈合速度及愈合组织胶原数量的比较,验证不同的状态的皮肤细胞对创面的影响。结果:1)通过胶原酶+胰酶(A组)、单一胰酶(B组)、组织贴壁(C组)三种方法消化皮肤组织,均可成功培养出以成纤维细胞为主的皮肤细胞群,多次传代培养后成纤维细胞呈优势生长,细胞伸展呈梭形或多边形。相比于传统的胰酶及组织贴壁法,采用胰酶+胶原酶消化法,细胞从组织块游离出效率最高,36 h即可观察有成纤维细胞呈放射状从组织块游离出,培养48 h细胞后,融合度达90%以上,且所得细胞产量最多,差异具有统计学意义(P<0.01)。2)通过免疫荧光检测皮肤细胞Vimentin表达,发现几乎所有的细胞均表达波形丝蛋白,HE染色后光镜观察细胞呈长梭形或多边形,胞核为深蓝色,胞浆为嗜碱性染色,说明所得皮肤细胞以成纤维细胞为主。3)通过CCK-8法分析不同消化组皮肤细胞的活性,发现A组细胞增殖活性明显高于B、C两组,差异具有统计学意义(P<0.05)。4)流式细胞术检测细胞表面标志分子CD44以评估皮肤细胞活性,发现胰酶+胶原酶体外消化法(A组)获得细胞CD44阳性表达率最高(100%),胰酶体外消化法(B组)次之(98.6%),而贴壁法(C组)CD44表达率最低(91.5%),三种方法所得细胞CD34、CD45表达均呈阴性,该结果说明不同方法获得体外细胞活性存在差异,胰酶+胶原酶消化法细胞活性最强,胰酶次之,贴壁法获得细胞活性最低。5)成功建立裸鼠急性创面模型,将正常培养的原代皮肤细胞,老化的皮肤细胞细胞及PBS对照每日涂抹创面,记录不同治疗组创面愈合时间,发现复合酶消化法获得细胞可在4天实现创面愈合,生理盐水对照组则需要7天完成创面愈合,老化的成纤维细胞组则需要10天完成创面愈合,差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01);取创面愈合14天的创面瘢痕组织进行HE染色,结果显示正常皮肤细胞治疗组,创面愈合组织胶原含量较高,胶原纤维增长增粗,排列整齐,更接近于非创面的正常皮肤组织,而老化皮肤细胞治疗组创面组织较薄,真皮层胶原最少,胶原排列稀疏无序。正常细胞治疗组瘢痕皮肤的胶原含量高于生理盐水组和老化细胞治疗组,差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。结论:1)本实验成功验证了此复合酶(胰酶+胶原酶)体外消化法,可以高效的获得皮肤原生代细胞。2)经免疫荧光鉴定,皮肤细胞以成纤维细胞为主,含有少量干细胞样的间充质细胞。3)复合酶消化法获得原代皮肤细胞数量及活性优于传统胰酶消化法及细胞贴壁法,但本实验的三种组织消化法获得的原代细胞的活性均在第4、5代时达到高峰,然后随体外传代的增加,细胞活性逐渐减低,体外培养的第4代、第5代活性较强,可能是细胞治疗较佳的窗口期。4)通过小鼠创面愈合模型证明成纤维细胞的细胞活性是细胞治疗的重要因素,老化的成纤维细胞可能无益于伤口愈合。