Humanin（HN）是一个由24个氨基酸残基组成的短肽,2001年首先由日本学者在阿尔采末病（Alzhemer’s disease,AD）患者的脑内发现。由于AD患者的枕叶在发病过程极少受累,他们据此推测,枕叶的神经元一定启动了某种基因的表达,并由此形成了特殊的保护机制,使神经元免受AD病变过程的毒性作用而死亡。最终他们发现了一种由24个氨基酸残基组成的新型多肽,并将其命名为HN。研究发现,在离体培养的细胞中,HN能有效抑制多种FAD基因（APP、PS-1和PS一2）、Aβ完整肽链（Aβ1-43或Aβ1-42）及其衍生物（Aβ25-35、Aβ31-35）诱发的神经毒作用;而且在大鼠在体AD模型中也发现了HN的神经保护作用。但他们的实验发现,HN对AD以外的损伤似乎不发挥保护作用。因此,HN被认为是AD特异或AD相关毒性（AD-related insults）的神经保护肽。然而,有关HN神经保护作用的细胞机制提示,HN的神经保护作用可能不只限于AD相关的神经毒。（1）HN分布于脑组织以外的其他组织及不同的动物种属,即HN的作用不只局限于神经组织;（2）HN可拮抗线粒体功能障碍;（3）HN可抑制不同途径的凋亡;（4）HN可拮抗Aβ引起的细胞内钙超载。HN的这些作用特点强烈提示,HN极有可能具有广泛的神经保护作用,而不只是针对某种特定损伤（如AD相关毒性）而产生保护作用的神经保护肽。因此,有必要在AD以外的损伤模型中进行验证并分析其机制,而谷氨酸（NMDA）造成的兴奋性神经毒由于具有使用普遍,毒性作用强,损伤机制复杂,临床意义重要等特点,因此成为验证HN具有广泛的神经保护作用的最理想的模型。基于上述假设,我们拟进行如下观察:1)采用培养的大鼠大脑皮层神经元,通过MTT、LDH及胞内Ca²⁺测定,建立NMDA诱导的兴奋性神经毒的细胞模型,通过氧自由基（reactive oxygenspecies,ROS）、NO检测,评价NMDA引起的线粒体损伤,通过电镜观察、TUNEL染色、caspase-3活性测定评价NMDA引起的神经元凋亡,并通过检测caspase-8和caspase-9的活性,初步分析外源性及内源性凋亡途径在神经元凋亡中发挥的作用;2)通过MTT、LDH、Calcein染色及胞内Ca²⁺测定,观察HN对NMDA引起的兴奋性神经毒的拮抗作用;3)通过激光共聚焦、流式细胞术及生化方法检测琥珀酸脱氢酶的活性、ROS水平、NO水平及线粒体膜电位的改变,观察HN对NMDA引起的线粒体损伤的拮抗作用;4)通过电镜观察、TUNEL染色、流式细胞术、激光共聚焦及生化检测,观察HN对NMDA诱发的凋亡的拮抗作用及机制;并通过检测LDH、MTT,结合各种Caspase抑制剂的使用,分析HN通过抑制凋亡对抑制兴奋性神经毒作用的贡献,即大致区分HN通过抑制凋亡或坏死在抑制兴奋性神经毒中发挥的作用。通过以上观察验证我们的假说,即HN不只是拮抗AD相关毒性的特异性神经保护肽,而是具有广谱保护作用的内源性神经活性多肽。由于HN主要在大脑皮层表达,又具有广谱神经保护作用,因此,HN将可能通过拮抗包括AD在内的神经退行性疾病及其他神经病理损伤发挥重要作用。第一部分:NMDA诱导的大鼠大脑皮层神经元神经毒性作用观察及机制探讨兴奋性神经毒是一个广泛应用的神经损伤模型。虽有相关报道,但目前兴奋性神经毒的细胞模型在应用NMDA的浓度、时间上差别很大。因此,为客观评价HN的神经保护作用,首先有必要摸索NMDA作用的浓度及时间,建立一个稳定的神经毒模型,以利于后续的一系列实验观察。方法:大鼠大脑皮层神经元培养,纯度达90%左右时,通过倒置显微镜下形态学观察、细胞活力检测（MTT及LDH释放的检测）及胞内Ca²⁺的动态测定,摸索NMDA毒性诱导的适当浓度及时间,建立兴奋性神经毒的细胞模型。并通过ROS、NO检测,分析模型中线粒体的损伤情况;通过电镜观察、TUNEL染色、caspase-3测定,研究模型中神经元的凋亡情况;并进一步通过检测模型中caspase-8、caspase-9的活性,分析外源性和内源性凋亡途径在神经元凋亡中发挥的作用。所有数据均经SPSS10.0处理获得,以均数±标准差（（?）±s）表示,组间均数的比较用one-way ANOVA分析和Dunnett多重比较,显著性水平设为0.05。结果:NMDA与皮层神经元共同孵育,引起了培养的皮层神经元形态学的改变,以及由NMDA造成的时间和浓度依赖性的神经元细胞活力的下降。而且,NMDA（100μmol/L,2h）造成了大鼠大脑皮层神经元细胞活力下降了47%,LDH释放增加66%,皮层神经元内Ca²⁺的快速升高,并维持在高水平形成一平台,ROS和NO的生成明显增加,电镜下凋亡形态出现,TUNEL染色阳性,caspase-3、caspase-8和caspase-9活性明显升高。上述结果提示:NMDA（100μmol/L）作用2h诱发了皮层神经元明显的细胞毒性,是一个比较理想的兴奋性神经毒模型。该模型观察到了细胞整体的结构及功能的损伤(MTT下降、LDH释放增加、Ca²⁺的快速升高),也观察到了线粒体功能的损伤。此外,该剂量的NMDA也诱发了皮层神经元的凋亡,内源性和外源性凋亡途径同时介导了该凋亡过程。第二部分:Humanin拮抗NMDA诱导的兴奋性神经毒的作用观察虽然HN被认为是AD特异或AD相关毒性（AD-related insults）的神经保护肽,然而,目前已积累的有关HN的细胞、分子水平的作用机制强烈提示,HN极有可能具有广泛的神经保护作用。本部分内容拟在前期建立的大鼠大脑皮层神经元的兴奋性神经毒细胞模型上,观察HN是否通过拮抗兴奋性神经毒而发挥保护作用。方法:原代培养大鼠大脑皮层神经元,通过倒置显微镜对培养细胞进行观察并确认NMDA毒性诱导的情况;实验共分5大组:1)对照组,正常培养的细胞;2)HN组,在培养的细胞中添加HN（10μmol/L）;3)NMDA组,亦即兴奋性神经毒的模型组,在培养液中加入NMDA（100μmol/L）和Gly（10μmol/L）,作用2h,观察NMDA引起的毒性作用;4)NMDA+MK-801（10μmol/L）组;5)NMDA+HN（各种浓度）组。用Fluro-3进行Ca²⁺探针标记,在激光共聚焦显微镜下,按以上分组要求加入干预,对神经元内Ca²⁺浓度进行动态检测,每660ms采集一次数据,共采集300次,即对每个细胞跟踪观察198s;NMDA毒性诱导24h后,检测培养液中LDH的活性,以反映神经元的受损情况;收集细胞进行MTT测定,评价存活神经元的生活状态;收集细胞行Calcein染色,反映神经元的存活数量,即通过LDH、MTT和calcein染色对神经毒进行评价。所有数据均经SPSS10.0处理、获得,以均数±标准差（（?）±s）表示,组间均数的比较用one-way ANOVA分析和Dunnett多重比较,显著性水平设为0.05。结果:1)HN抑制了NMDA引起的神经元内Ca²⁺浓度的升高。在跟踪观察的198s时间内,NMDA引起了神经元内Ca²⁺的快速升高,并始终维持在高水平形成一平台;HN（0.1μmol/L）不能拮抗NMDA升高Ca²⁺的作用;HN（1μmol/L）虽未能阻止NMDA升高神经元内Ca²⁺的作用,但能使升高的Ca²⁺迅速降至对照水平。2)HN抑制了NMDA引起的存活神经元的减少。Calcein染色显示,NMDA引起了存活神经元数量的明显减少,为对照组的51.3%;预先应用HN（100μmol/L）几乎完全抑制了NMDA引起的神经元减少,存活神经元恢复到98.6%。3)HN抑制了NMDA引起的神经元细胞活力的下降。MTT检测提示,NMDA引起细胞活力下降约47%,而HN浓度依赖性地抑制了NMDA引起的神经元细胞活力的下降;4)HN降低了NMDA引起的神经元LDH的释放。虽然HN不能完全阻断NMDA引起的LDH释放,但HN可剂量依赖性地使之降低。上述结果提示:1)HN抑制了NMDA引起的神经元内Ca²⁺浓度的升高;2)HN阻止了NMDA引起的细胞活力的下降,抑制了NMDA所致的LDH释放,拮抗了NMDA所致存活神经元的减少。即HN可通过拮抗NMDA引起的兴奋性神经毒而发挥神经保护作用。第三部分:Humanin拮抗NMDA诱导的线粒体损伤的作用观察谷氨酸（NMDA）诱导的兴奋性神经毒通过过度激活NMDA受体,引起细胞内Ca²⁺超载,造成神经元损伤,直至凋亡或坏死。线粒体既是细胞的能量工厂,又是重要的Ca²⁺库,在缓解细胞Ca²⁺超载方面发挥重要作用。然而,当线粒体缓解Ca²⁺的能力超过极限时,线粒体功能也遭到破坏,因此,兴奋性神经毒可造成线粒体功能的损伤。由于前期的实验观察已证实,HN可拮抗NMDA诱导的兴奋性神经毒,包括抑制NMDA诱导的细胞内Ca²⁺的升高,本部分内容拟观察HN通过拮抗NMDA造成的线粒体损伤而发挥的神经保护作用。方法:原代培养大鼠大脑皮层神经元,通过倒置显微镜对培养细胞进行观察并确认NMDA毒性诱导的情况。实验共分5大组:1)对照组,正常培养的细胞;2)HN组,在培养的细胞中添加HN（10μmol/L）;3)NMDA组,亦即兴奋性神经毒的模型组,在培养液中加入NMDA（100μmol/L）和Gly（10μmol/L）,作用2h,观察NMDA引起的毒性作用;4)NMDA+MK-801（10μmol/L）组;5)NMDA+HN（各种浓度）组。NMDA毒性作用2h后,收集培养介质进行NO含量的定量分析;收集细胞,用JC-1标记线粒体膜电位,用DCFH-DA标记ROS,通过流式细胞术分析标记荧光的荧光强度,通过激光共聚焦显微镜检测提供形态学依据,从而对ROS含量和线粒体膜电位进行检测;NMDA毒性作用24h后,收集细胞,通过MTT对琥珀酸脱氢酶活性进行分析。所有数据均经SPSS10.0处理、获得,以均数土标准差（（?）±s）表示,组间均数的比较用one-way ANOVA分析和Dunnett多重比较,显著性水平设为0.05。结果:1)HN抑制了NMDA引起的琥珀酸脱氢酶活性的降低。MTT检测提示,NMDA使琥珀酸脱氢酶活性下降约47%,而HN浓度依赖性地抑制了NMDA的作用;2)HN阻止了NMDA引起的线粒体膜电位（Δψm）的降低。用JC-1标记线粒体膜电位,通过激光共聚焦显微镜和流式细胞术检测JC-1的红色荧光强度。JC-1在具有正常膜电位的线粒体中发出红色荧光,因此,细胞红色荧光越强,表示具有的正常线粒体越多,反之,细胞中的线粒体膜电位下降越多。激光共聚焦显微镜下照片显示,与对照组相比,NMDA引起了线粒体膜电位下降,表明HN抑制了NMDA对线粒体膜电位的作用。用流式细胞术对JC-1的红色荧光强度进行了定量分析,结果与激光共聚焦显微镜检测一致;3)HN抑制了NMDA引起的ROS的生成。用DCFH-DA标记细胞,通过激光共聚焦显微镜和流式细胞术检测DCF的荧光强度。激光共聚焦显微镜下照片显示,与对照组相比,NMDA引起了ROS的生成增加;HN阻止了NMDA引起的ROS的生成增加,表明HN抑制了NMDA对ROS生成的影响。用流式细胞术对DCF荧光强度进行了定量分析,结果与激光共聚焦显微镜检测一致;4)HN降低了NMDA引起的NO生成。与对照组相比,NMDA引起NO生成明显升高;而提前应用HN则可明显抑制NMDA引起的NO生成,与对照组相似。上述结果提示:1)HN抑制了NMDA引起的琥珀酸脱氢酶活性的降低;2)HN抑制了NMDA引起的线粒体膜电位（Δψm）的降低;3)HN抑制了NMDA引起的ROS和NO的生成。即HN可能通过拮抗线粒体功能损伤在抑制兴奋性神经毒中发挥神经保护作用。第四部分:Humanin拮抗NMDA诱导的神经元凋亡的作用观察兴奋性神经毒使神经元以凋亡或坏死两种形式死亡。由于细胞凋亡是迟发性的、程序性的细胞死亡,因此被认为是可控制和调节的,凋亡也因此成为研究的热点。线粒体介导的内源性凋亡途径是重要的凋亡途径之一,而且还可以借助于Bid与外源性途径发生联系。因此,线粒体在凋亡的发生中处于无可替代的重要地位。我们的前期研究发现,HN可拮抗NMDA诱导的兴奋性神经毒,而且可拮抗NMDA诱导的线粒体损伤。那么,HN是否可抑制NMDA诱导的神经元凋亡呢?本部分内容拟观察HN通过拮抗NMDA诱导的神经元凋亡而发挥的神经保护作用。方法:原代培养大鼠大脑皮层神经元,通过倒置显微镜对培养细胞进行观察并确认NMDA毒性诱导的情况;实验共分5大组:1)对照组,正常培养的细胞;2)HN组,在培养的细胞中添加HN（10μmol/L）;3)NMDA组,亦即兴奋性神经毒的模型组,在培养液中加入NMDA（100μmol/L）和Gly（10μmol/L）,作用2h,观察NMDA引起的毒性作用;4)NMDA+MK-801（10μmol/L）组;5)NMDA+HN（1μmol/L）组。在毒性作用6h后,收集细胞进行电镜观察、TUNEL染色、caspase-3活性测定,证实NMDA诱导神经元凋亡的发生;通过PI染色、流式细胞术定量分析及caspase-3活性测定,评价HN对凋亡的拮抗作用。通过caspase-8、caspase-9活性测定,评价外源性及内源性凋亡途径在NMDA诱导的兴奋性神经毒中的作用,以及HN对外源性及内源性凋亡途径的抑制作用。通过使用caspase-8和总caspases抑制剂,结合MTT和LDH检测,初步分析HN通过抑制凋亡和（或）坏死在抑制兴奋性神经毒发生中的作用。通过使用caspase-8抑制剂,结合NO检测,分析兴奋性神经毒发生时外源性凋亡途径对线粒体功能的影响。所有数据均经SPSS10.0处理、获得,以均数士标准差（（?）±s）表示,组间均数的比较用one-way ANOVA分析和Dunnett多重比较,显著性水平设为0.35。结果:1)电镜观察、TUNEL染色、caspase-3活性测定一致表示,NMDA诱导了神经元凋亡,而PI的流式细胞术定量分析及caspase-3活性测定显示,HN可抑制NMDA诱导的神经元凋亡。2)caspase-8和caspase-9活性测定显示,外源性及内源性凋亡途径共同参与了NMDA诱导的兴奋性神经毒中神经元的凋亡,而HN对外源性凋亡途径所致的神经元凋亡有一定的抑制作用。3)通过使用caspase-8的抑制剂（IETD）并结合MTT和LDH检测,发现外源性凋亡途径在NMDA诱导的兴奋性神经毒中的贡献不大。因此,HN通过抑制外源性凋亡途径对NMDA诱导的兴奋性神经毒发挥的神经保护作用也是有限的。4)通过使用总caspases抑制剂（VAD）并结合MTT和LDH检测发现,caspase依赖的凋亡在NMDA诱导的兴奋性神经毒中的贡献不大。因此,HN通过抑制caspase依赖的凋亡对NMDA诱导的兴奋性神经毒而发挥的神经保护作用也是有限的。5)通过使用caspase-8抑制剂,结合NO检测,发现caspase-8被抑制后NO水平降低,因此,HN可能通过抑制外源性凋亡途径影响NO的生成。上述结果提示:1)HN对NMDA诱发的皮层神经元的凋亡具有一定的抑制作用;2)HN可能通过抑制外源性途径抑制NMDA诱导的凋亡;3)HN通过抑制caspases依赖的凋亡在抑制兴奋性神经毒中的作用并不明显;4)HN可能通过抑制caspase-8的激活而抑制NO的生成,从而抑制NMDA通过NO造成的神经损伤。结论:1)NMDA（100μmol/L）作用2h诱发了皮层神经元明显的细胞毒性,造成了线粒体损伤和神经元凋亡,是一个比较理想的兴奋性神经毒模型;2)HN可通过拮抗NMDA引起的兴奋性神经毒而发挥神经保护作用;3)HN可能通过拮抗线粒体功能损伤在抑制兴奋性神经毒中发挥神经保护作用;4)HN可抑制NMDA引起的外源性凋亡途径介导的神经元凋亡,并可抑制caspase-8介导生成的NO造成的神经损伤。