【摘 要】
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秸秆是自然界中广泛存在的可再生资源。但目前我国对秸秆的利用率低,资源严重浪费。由于微生物产生的纤维素酶在秸秆的高效降解中发挥重要作用,因此本课题首先开展了接种量、温度、通气量、料水比和基质粒径对B.subtilis固态发酵产酶和秸秆降解特性的影响研究,分析了其酶学特性。在此基础上,开展了外加Ca2+条件下B.subtilis产纤维素酶的特性研究,并通过高通量转录组测序在转录水平上对差异表达基因进行
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秸秆是自然界中广泛存在的可再生资源。但目前我国对秸秆的利用率低,资源严重浪费。由于微生物产生的纤维素酶在秸秆的高效降解中发挥重要作用,因此本课题首先开展了接种量、温度、通气量、料水比和基质粒径对B.subtilis固态发酵产酶和秸秆降解特性的影响研究,分析了其酶学特性。在此基础上,开展了外加Ca2+条件下B.subtilis产纤维素酶的特性研究,并通过高通量转录组测序在转录水平上对差异表达基因进行分析,探讨了Ca2+诱导B.subtilis纤维素酶合成的生物学机制。首先,论文对固态发酵产酶条件进行了优化。结果表明,在接种量30%、温度40°C、通气量0.6 L/min、料水比1:5和基质粒径0.84 mm条件下FPase、β-葡萄糖苷酶和CMCase酶活最高,分别为2.79 IU/g、4.23 IU/g、14.62 IU/g。酶学性质的分析结果表明,FPase、β-葡萄糖苷酶在50°C,CMCase在60°C条件下具有最大酶活力,在p H值为7时酶活力和酸碱稳定性最佳;Mg2+、Ca2+和Mn2+能激活酶促反应,而K+抑制了酶活力;酶对于0.5 M Na Cl具有较好的耐受性,但2 M Na Cl对酶促反应的抑制作用显著。通过对发酵基质进行表征分析,发现木质纤维素的组成和结构发生了改变,发酵后秸秆的结晶度较发酵前降低了30.17%。为了探索固态好氧发酵产酶的诱导特性,论文开展了Ca2+对B.subtilis固态好氧发酵产酶的影响研究。研究结果表明,在5 m M Ca2+处理条件下,FPase(4.20 IU/g)和CMCase(18.60 IU/g)酶活最高,是对照组的1.3-1.61倍。此条件对应的胞外蛋白含量达到13.77 mg/g,半纤维素、纤维素、木质素降解率为32.39%、41.23%、22.73%。同时,Ca2+诱导条件下纤维素酶合成相关基因q PCR检测结果表明,Ca2+处理能上调这些基因的表达倍数,而培养基中添加Ca2+螯合剂EGTA,则这些基因的表达倍数下调,实验结果进一步证实了Ca2+参与了B.subtilis纤维素酶合成的诱导作用。为了进一步揭示Ca2+诱导B.subtilis纤维素酶合成的机制,论文开展了转录组研究,共筛选到912个差异基因(342个上调表达基因和570个下调表达基因)。对与纤维素酶家族、碳水化合物代谢、转运蛋白有关的基因进行解析,结果表明,差异基因主要编码CAZy家族中GT、GH和PL家族的酶。与糖酵解过程有关的基因上调程度最为显著,推测糖酵解途径可能在代谢碳水化合物中发挥主要作用。ABC转运蛋白可能与纤维素酶的合成及其对纤维素的降解相关。实验结果最终表明,在Ca2+诱导条件下,碳水化合物代谢活性增强,葡萄糖及时被转化和利用,可能缓解了葡萄糖的终产物抑制效应,有利于细胞内纤维素酶的合成。此外,Ca2+上调了编码ABC转运蛋白基因的表达水平,加强了小分子糖类的转运活力,基于这些小分子糖类对纤维素酶合成的诱导效应,引起胞内纤维素酶相关基因表达上调,从而促进了B.subtilis纤维素酶的合成。
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