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在工业酶生产技术应用中,利用纤维素酶、半纤维素酶降解木质纤维素等可再生资源,转化得到各种低碳环保的生物燃料和各种化工产品,对减缓不可再生资源消耗、环境保护和可持续资源与经济的发展具有重要意义。以里氏木霉和草酸青霉为代表的丝状真菌是木质纤维素降解酶类的主要生产者。已有研究表明,胞外蛋白主要由菌丝顶端分泌,丝状真菌的菌丝形态影响其胞外蛋白的产生,某些菌丝形态发生改变的菌株表现出了更高的产酶能力。同时菌体的生长、分泌囊泡运输以及蛋白质分泌过程具有密切的联系,提示菌丝生长、囊泡运输和蛋白质分泌是工业丝状真菌生产胞外蛋白的关键因素。CrzA/Crz1（calcineurin-responsive zinc finger 1）是参与真菌细胞壁重塑过程的重要的转录调控因子。CrzA作为细胞中钙调神经磷酸酶（CN）重要的下游响应因子,对于真菌的菌丝形态的形成具有重要的调控作用。Exocyst复合体是囊泡与质膜的拴系过程中重要的栓系因子,其在细胞的组成型分泌和极化性胞吐过程中必不可少,影响菌丝的极性生长和胞外蛋白的顶端分泌。本论文的研究主要分为两个部分:（1）对CrzA在草酸青霉菌丝形态和蛋白分泌过程的调控机制进行了研究,同时探索了CrzA与其它蛋白的相互作用,提出了CrzA调控转录并因此影响胞外纤维素酶合成的可能机制。（2）在具有较强蛋白分泌能力的里氏木霉中,对Exocyst复合体各亚基进行了鉴定,并对Sec3、Sec5、Sec15和Exo70四个较重要亚基在里氏木霉的菌丝形态及蛋白分泌过程中的功能进行了初步探索。研究内容和结果如下:1.CrzA在草酸青霉中的功能研究以草酸青霉114-2为出发菌株,研究了CrzA对菌丝形态及纤维素酶编码基因的转录以及纤维素酶合成的影响。结果显示,CrzA对草酸青霉的菌落延伸、分生孢子形成以及胞外蛋白分泌能力都具有重要作用,其正常表达是菌丝生长、纤维素酶编码基因正常转录及胞外蛋白正常分泌的关键因素。CrzA的缺失使得草酸青霉的菌丝形态严重受损,主要体现在菌落直径减小、菌丝极性延伸受损、菌丝分支增加、孢子产量急剧降低以及液体发酵时菌丝体不再松散而是呈现较为紧密的菌丝球形式。CrzA的缺失显著下调了草酸青霉菌株中分生孢子色素合成基因和孢子壁合成相关基因的表达水平,对孢子发生过程相关的基因的表达水平也具有调控作用。BrlA、FlbA、FlbB、FlbC和StuA的编码基因在△crzA中的转录水平均显著降低,以上五个调控蛋白已被证实是草酸青霉中控制分生孢子形成过程的早期调控转录因子,这解释了△crzA突变体中分生孢子减少的原因。与出发株114-2相比,ΔcrzA菌株产生纤维素酶的能力以及分泌胞外蛋白的总量大幅度降低。表达谱分析结果显示,CrzA的缺失能够广泛下调纤维素酶编码基因的表达水平,说明CrzA通过影响纤维素酶编码基因表达引起纤维素酶合成能力的改变。使用串联亲和纯化技术捕捉到了包括Cyc8在内的6个与CrzA蛋白存在相互作用的蛋白,结合转录组研究结果,提出了草酸青霉CrzA调控纤维素酶基因表达的三种可能途径:（1）CrzA通过直接与某些纤维素酶编码基因的启动子区结合,然后招募Tup1-Cyc8复合物。此时Tup1-Cyc8复合物发挥激活功能,激活纤维素酶编码基因的表达,CrzA的缺失则抑制了纤维素酶编码基因的转录;（2）CrzA结合Xyr1纤维素酶编码基因的启动子后,激活xyr1的表达,CrzA的缺失抑制了xyr1基因的转录,间接阻遏纤维素酶编码基因的表达;（3）CrzA的缺失下,纤维素酶编码基因表达的阻遏因子CreA结合更多的Tup1-Cyc8复合物,阻遏纤维素酶编码基因的表达。2.里氏木霉中Exocyst复合体功能初探在具有较强蛋白分泌能力的里氏木霉中,鉴定了 Exocyst复合体的八个亚基（Sec3、Sec5、Sec6、Sec8、Sec10、Sec15、Exo70 和 Exo84）,且确认了它们均为菌株生长所必需蛋白,其缺失导致真菌死亡。选择了与细胞质膜具有直接相互作用的Sec3和Exo70、与囊泡有直接相互作用的Sec15以及介导亚基之间相互作用的中心蛋白Sec5这四个较为重要的亚基,使用铜离子响应启动子替代策略对它们在里氏木霉中的功能进行了研究。研究表明,Sec3、Sec5、Sec15、Exo70四个亚基与里氏木霉菌丝顶端延伸以及菌丝分支的过程密切相关,体现了Exocyst复合体在菌丝顶端生长中的重要作用。突变菌株Ptcu1-sec5在含有80 μM Cu2+的培养基中其菌落几乎不再延伸,与出发株相比,菌丝生长单位长度下降了81.5%,菌丝分支显著增多,说明Sec5作为介导Exocyst复合体其它各亚基之间相互作用的中心蛋白,对于菌丝体的极性延伸和菌丝分支发挥着极其重要的作用。在不同碳源诱导条件下,突变菌株Ptcu1-sec5、Ptcu1-sec15和Ptcu1-exo70表现出了不同的蛋白分泌能力。当Sec5的表达下调时,Ptc1-sec5突变株在含有铜离子的纯纤维素诱导条件下,表现出较低的蛋白分泌能力,说明Sec5在此过程中发挥正调控作用。而Ptcu1-sec15和Ptcu1-exo 70在此条件下则未表现出明显差异,且Ptcu1-sec5、Ptcu1-sec15和Pcu1-exo70在含有2%玉米浆和2%微晶纤维素的纤维素酶诱导培养基中均未表现出与出发株明显不同的胞外蛋白分泌能力,提示Sec5、Sec15、Exo70这几个重要亚基在响应不同外源信号时调控的复杂性。