狂犬病（Rabies）是由狂犬病病毒（Rabies virus,RABV）入侵人或动物中枢神经系统（Central Nervous System,CNS）所引起的一种人兽共患传染病。患者一旦出现临床症状,病死率超过99.9%。世界卫生组织（World Health Organization,WHO）提示,动物口服狂犬病疫苗接种可以预防狂犬病病毒在陆地食肉动物种群中传播,并降低对家畜和人类的感染风险。在我国,散养犬猫、流浪狗及野生动物的数量较多,很难集中注射疫苗,并且注射型疫苗价格高,注射过程冗繁,无法对野生动物大范围接种形成有效免疫圈。同时,我国市场上尚无通过口服免疫诱导机体产生有保护性狂犬病病毒中和抗体的疫苗。所以研究一种安全、高效、便捷的新型基因工程狂犬病口服疫苗极其重要。表达狂犬病病毒三个拷贝糖蛋白基因的重组腺病毒AdHu5-tRVG-hrGFP,是一款能经口服途径接种的重组狂犬病疫苗毒株。海藻酸钠（Sodium Alginate,Na Alg,AGS）是一种天然多糖,具有药物制剂辅料所需的稳定性、粘性和安全性等,且已经在医药领域得到广泛的应用。本研究以Ad Hu5-tRVG-hrGFP为模式病毒,将海藻酸钠作为缓释材料,剂型选择制作工艺简单的海藻酸钠微丸,制备Ad Hu5-tRVG-hrGFP株的口服疫苗,并对口服疫苗诱导小鼠免疫应答进行研究,以期为狂犬病的预防及治疗提供更好的参考。首先,对人源胚肾转化细胞（Ad5-293）进行培养及AdHu5-tRVG-hrGFP毒株鉴定和扩大培养。参考谭业平博士设计的Ad Hu5-tRVG-hrGFP毒株特异性鉴定引物（t RVG-FP/RP）,对该毒株DNA进行抽提、PCR扩增和鉴定。PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果显示扩增出特异的目的条带,大小约1,780 bp,与预期结果一致。通过Ad5-293细胞培养重组腺病毒毒株Ad Hu5-tRVG-hrGFP,共收获80 m L病毒液,TCID50法测定其滴度为107.1FFU/m L。其次,以单因素实验和正交实验探索海藻酸钠微丸制备工艺。通过单因素实验考察了海藻酸钠溶液浓度、海藻酸钠溶液与病毒液体积比例、氯化钙溶液的浓度及固化时间对微丸包封率、载药量及滴加速度和滴距的影响,通过L9（3~4）正交实验得出微丸的最佳制备工艺条件。正交实验结果显示最佳制备工艺为:海藻酸钠溶液浓度为2%,海藻酸钠溶液与病毒液体积比例为1∶2,氯化钙溶液浓度为0.4 mol/L,固化时间为30 min,滴距为8 cm,滴加速度为2.5 m L/min。由极差分析的结果显示微丸质量影响因素依次为:海藻酸钠溶液浓度（AGS）＞氯化钙溶液浓度（CaCl2）＞海藻酸钠溶液与病毒体积比＞固化反应时间。此工艺条件下制备的微丸凝聚物的包封率为78.86%,载药量为15.16%。通过TCID50方法测定该工艺制备的未冻干微丸病毒Ad Hu5-tRVG-hrGFP的滴度为105.5FFU/m L。以TCID50法测定未冻干微丸人工胃液耐受性,实验显示该微丸在模拟胃液处理2 h时,病毒滴度开始轻微下降,提示该微丸具有抵抗胃酸的潜力。最后,通过小鼠口服免疫微丸,以荧光抗体病毒中和试验（Fluorescent antibody virus neutralization test,FAVN）检测小鼠血清中和抗体效价对口服疫苗诱导小鼠免疫效果进行观察,免疫原性实验显示:直接口服Ad Hu5-tRVG-hrGFP病毒液小鼠在21 d的时候75%的小鼠产生了保护性抗狂犬病的抗体,口服未冻干Ad Hu5-tRVG-hrGFP微丸小鼠50%产生保护性抗狂犬病的抗体。攻毒保护实验显示,对直接口服Ad Hu5-tRVG-hrGFP病毒液21 d后诱导的抗体抵抗狂犬病病毒标准攻击毒株CVS-24攻击的小鼠保护率为100%,口服未冻干Ad Hu5-tRVG-hrGFP微丸小鼠保护率为50%。以上实验结果表明以AdHu5-tRVG-hrGFP为模型,海藻酸钠为缓释材料,制成重组腺病毒海藻酸钠缓释微丸具有口服疫苗的潜力;本研究为新型狂犬口服疫苗的研制提供了参考。