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肿瘤坏死因子(TNF-α)在体内大量释放会介导多种疾病的发生,它主要通过与细胞膜上受体(Ⅰ型和Ⅱ型)结合从而发挥其生理学活性。可溶性肿瘤坏死因子Ⅰ型受体(sTNFR1)是肿瘤坏死Ⅰ型受体(TNFR1)的胞外区域,它可以竞争性阻断TNFR1与TNF结合,降低TNF对细胞的毒性。因此,sTNFR1可以作为TNF-α的拮抗剂,联合TNF-α用于疾病的治疗,在医学领域具有重要的研究价值。本文即通过优化大肠杆菌表达系统,实现sTNFR1在大肠杆菌中的异源表达,获得较高纯度的sTNFR1蛋白,为研究sTNFR1的生理学活性、疾病治疗方面的应用及其作为药物蛋白未来实现低成本大量表达与制备奠定了良好基础。本文将人源sTNFR1基因克隆到pET-22b表达载体,成功构建了重组质粒pETH1,电转到大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌株中进行摇瓶发酵,SDS-PAGE凝胶电泳结果显示,目标蛋白全部以包涵体的形式存在于沉淀中。为了提高sTNFR1在大肠杆菌中的可溶性表达,首先,应用融合标签技术来提高sTNFR1可溶性表达,选择了DsbC、MBP、TrxA和NusA四种在大肠杆菌中适用的融合标签,SDS-PAGE凝胶电泳结果显示,相较于其它三个标签,在sTNFR1的N端融合NusA标签效果最好,使sTNFR1的可溶性表达量提高了20%。其次,为了进一步促进sTNFR1可溶性表达,在NusA-sTNFR1的基础上,共表达了七种胞内的分子伴侣质粒以及酵母二硫键从头合成体系中的巯基氧化酶Erv1来辅助sTNFR1蛋白正确折叠,筛选出tig分子伴侣对sTNFR1蛋白可溶性表达有明显的促进作用,使sTNFR1在大肠杆菌中的可溶性表达可以达90%。对EC12菌株进行摇瓶发酵,从诱导温度和IPTG诱导浓度两方面对发酵条件进行初步优化,SDS-PAGE凝胶电泳结果显示,诱导温度为25oC,IPTG终浓度为0.5 mM,TB作为发酵培养基时,sTNFR1蛋白总体以及胞内可溶性表达水平最高。最后,对可溶性蛋白进行Ni-NTA亲和层析纯化后,TEV蛋白酶酶切去除N端的NusA标签,并结合Western Blot分析鉴定,证实表达产物即为sTNFR1蛋白并获得较高纯度的sTNFR1蛋白。综合前期研究结果进一步优化表达系统,初步研究sTNFR1蛋白在大肠杆菌中的胞外分泌表达。首先,筛选合适的信号肽,构建分别带有OmpA、LamB、DsbA、TorT和phoA五种信号肽的工程菌株,SDS-PAGE凝胶电泳结果显示,信号肽TorT可引导sTNFR1分泌到胞外,但分泌量较低。为了提高sTNFR1胞外分泌量,分析其分泌瓶颈可能是因为目标蛋白无法跨越细胞膜,导致蛋白分泌受阻,因此,分别共表达了磷脂酶C和角质酶增加细胞膜的通透性,从而促进蛋白外排。结果显示,胞外分泌量未有明显增加,后续需进一步分析其分泌瓶颈。