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原始生殖细胞在小鼠中起源于6.5 dpc胚胎的近末端外胚层,受Wnt信号和BMP信号诱导形成。PGCs在9.5 dpc开始沿肠系膜向生殖脊迁移,在迁移的过程中伴随着细胞增殖,在12.5 dpc基本全部进入生殖脊,13.5 dpc停止有丝分裂,随后进入性别分化阶段。在PGCs的形成、增殖、迁移过程中,表观遗传修饰如DNA甲基化、H3K9me2、H3K27me3发生变化。有报道称PGCs中H3K27me3的增加与PRC2有关。PGCs的形成数量和迁移决定了个体的生殖能力,遗传性疾病可能导致原始生殖细胞的减少,造成成年个体的不孕不育。PGCs的迁移异常,导致性腺外生殖细胞肿瘤的发生。哺乳动物Pcl1、Pcl2、Pc13是与果蝇Pcl同源的三个基因,它们分别将PRC2募集到染色质上对H3的27位赖氨酸进行甲基化修饰,调节基因的表达。目前Pcls在染色质上的表观遗传调控研究的较为清楚。Pcls除了作为PRC2的亚基发挥功能,本身也能作为细胞因子发挥功能。据报道,Pcls在癌症发生发展中也发挥重要作用。但是Pcls在生殖细胞发育过程中的作用研究较少。本研究表明,Pcl2、Pc13在PGCs中显著高表达,Pcl1-3在早期生殖腺中表达较高。Pcl1-3在睾丸中表达且在精原细胞和曲细精管特定阶段的精母细胞中高表达。Pcl3的敲除促进PGCs的增殖,但是Pcl3的敲除导致PGCs在10.5 dpc小鼠后肠中的滞留数量增加,12.5 dpc时大量的PGCs异位。本文揭示了 Pcls在PGCs和成年雄性小鼠生殖细胞中的表达,研究了 Pcl3在PGCs增殖和迁移中的作用,加深了对Pcls的功能认识,对认识生殖细胞肿瘤的形成具有一定的积极意义。研究目的:研究Pcls在小鼠原始生殖细胞的增殖及迁移中的作用。研究方法:1.通过原位杂交实验,观察Pcls在9.5 dpc胚胎中的组织分布。2.对GEO数据库转录组数据进行分析并作图,明确PRC2各亚基在PGCs中的表达情况。3.对GEO数据库转录组数据进行分析并作图,明确Pcls在9.5-15.5 dpc胎鼠PGCs中的表达变化。4.通过对多个Pcls相关数据库进行基因表达差异分析和基因富集分析,寻找Pcls调节的与PGCs发育相关的作用因子。5.通过半定量实验检测12.5 dpc的胎鼠性腺及成鼠性腺的Pcls表达。6.TAM诱导小鼠的Pcl3敲除,通过对10.5 dpc胎鼠进行整胚胎碱性磷酸酶染色和EdU染色检测Pcl3敲除后对PGCs的增殖影响。7.TAM诱导小鼠的Pcl3敲除,通过对10.5 dpc小鼠进行切片和免疫荧光染色检测Pcl3敲除后对PGCs迁移的影响。8.TAM诱导小鼠的Pcl3敲除,通过对12.5 dpc小鼠性腺及周围组织进行切片和免疫荧光染色,观察Pcl3敲除后对PGCs数量及迁移的影响。9.通过Western Blot实验和免疫组化实验检测Pcls在成年雄性生殖器官中的组织分布。研究结果:1.原位杂交实验表明,Pcls在9.5 dpc胎鼠的背部神经管表达较高,通过切片发现,Pcl3在PGCs中显著表达。2.13.5 dpc胎鼠PGCs转录组数据基因表达差异分析表明,与体细胞相比在PGCs中PRC2多个亚基在PGCs中显著高表达,包括Pcl2、Pcl3,而PGCs中Pcl1的表达与体细胞相比较无显著差异。3.对GEO数据库GSE94136中的数据作图分析表明,Pcl2和Pcl3在9.5 dpc到15.5 dpc在胎鼠的PGCs中表达较高,Pcl1的表达较低;随着胎鼠的发育,Pcl3的表达水平下降,Pcll的表达水平逐渐升高,Pcl2的表达水平基本一致。4.通过绘制维恩图,我们找到876个可能受Pcl3敲除影响较大的基因,并对876个基因进行基因富集分析,我们发现这些基因在在细胞周期,核转运和p53信号通路富集。5.通过对胎鼠及成年小鼠生殖腺半定量分析,并对结果进行灰度分析发现,Pcl2在胎鼠及成年鼠的生殖腺中表达都较高,Pcl1、Pcl3在早期生殖腺中表达较高。相比较于Pcl1、Pcl2,Pcl3在成年生殖腺和生殖细胞中表达较低。6.通过TAM诱导胎鼠Pcl3敲除,对胎鼠进行整体碱性磷酸酶染色,我们发现同对照相比较,敲除小鼠的PGCs数目增加。通过EdU法检测细胞增殖,发现相比较于对照组,Pcl3敲除后,PGCs的增殖细胞百分比极显著的升高。7.通过TAM诱导胎鼠Pcl3敲除,对收集的胚胎进行冰冻切片和SSEA-1免疫荧光染色,统计PGCs的位置,发现处于后肠和肠系膜中的PGCs占总体的百分比没有显著的差异,但是Pcl3敲除后处于后肠的总细胞数同对照组相比较极显著的增加。8.12.5 dpcPcl3敲除胎鼠的性腺碱性磷酸酶染色显示PGCs数量增加;通过对12.5 dpc胎鼠性腺及周围组织切片,SSEA-1免疫荧光染色发现同对照组相比较,Pcl3敲除后在12.5 dpc时仍处于肠系膜处的PGCs数量显著的增加。9.通过对3M大成鼠睾丸和附睾提取蛋白进行Western Blot实验,我们发现,Pcls在睾丸中表达,在附睾中的表达很低。通过对睾丸组织进行免疫组化实验,我们发现,Pcls在特定曲细精管阶段的精母细胞中表达较高。结论:1.Pcl2、Pcl3在PGCs中高表达,在PGCs的发育过程中Pcls的表达具有相关性。2.Pcl3敲除促进PGCs的增殖,小鼠的PGCs数量增加,并且导致滞留在后肠中的PGCs数量增加。3.12.5 dpc Pcl3敲除胎鼠迁移到性腺中的PGCs数量增加,仍处于肠系膜处的PGCs数目相比于对照组增加。