【摘 要】
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华贵栉孔扇贝（Chlamys nobilis Reeve）是我国南方重要的海水养殖贝类,然而频繁暴发的大规模死亡事件,给扇贝养殖业造成了巨大的经济损失。由副溶血性弧菌（Vibrio parahemolyticus,V.p.）感染引起的细菌性疾病是大规模死亡现象的重要诱因之一。尽管可以通过改善养殖方式,优化养殖结构等方法来缓解这一问题,但培育抗病性强的扇贝优良品种才是解决病害问题的根本途径。本研究以
【基金项目】
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国家重点研发计划“蓝色粮仓科技创新”重点专项（2018YFD0901400）； 国家自然科学基金面上项目（31872563、42106126）； 现代农业产业技术体系建设项目-贝类（CARS-49）； 广东省重点领域研发计划项目（2021B0202020003）；
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华贵栉孔扇贝（Chlamys nobilis Reeve）是我国南方重要的海水养殖贝类,然而频繁暴发的大规模死亡事件,给扇贝养殖业造成了巨大的经济损失。由副溶血性弧菌（Vibrio parahemolyticus,V.p.）感染引起的细菌性疾病是大规模死亡现象的重要诱因之一。尽管可以通过改善养殖方式,优化养殖结构等方法来缓解这一问题,但培育抗病性强的扇贝优良品种才是解决病害问题的根本途径。本研究以华贵栉孔扇贝“南澳金贝”为研究对象,首先通过弧菌感染胁迫筛选存活个体作为亲本构建选育家系,以随机挑选的未感染个体作为亲本构建对照群体,然后在幼虫期、稚贝期和成贝期分别进行弧菌攻毒实验,比较各家系和对照群体的存活率,并以壳长为指标评价生长速度差异;接着对感染后的选育家系和对照群体的幼虫进行转录组测序分析,获得差异表达基因并进行相关代谢通路富集分析,筛选出差异表达显著的免疫应激相关基因;最后对Bcl-2相关抗凋亡基因3即BAG3基因进行全长克隆及蛋白结构预测分析,通过荧光定量PCR、RNAi与Western Blot免疫印迹等手段对该基因进行组织特异表达分析和功能验证。主要结果如下:1.选育家系的构建和性状比较:构建选育家系8个（记为#1、#2…#8）及对照群体1个（记为CP）,在其生长发育的不同阶段分别进行弧菌感染胁迫及生长指标测定,结果显示:幼虫期5个家系的存活率高于对照群体,其中家系1和4的存活率显著高于对照群体（P＜0.05）;稚贝期3个家系的存活率高于对照群体,其中家系3的存活率显著高于对照组（P＜0.05）,弧菌刺激后,3个选育家系血清中SOD酶活力水平低于对照群体,CAT酶活力较对照群体率先升高至峰值水平;成贝期2个家系的存活率高于对照群体,其中家系1和4与对照群体之间存在显著（P＜0.05）和极显著差异（P＜0.001）。此外,对生长数据的测定结果显示,家系4的生长速度极显著快于对照群体（P＜0.01）。2.差异表达基因筛选:转录组数据结果显示,选育家系与对照群体间存在3,428个差异表达基因,其中上调基因1,874个,下调基因1,554个。结合数据库分析发现,选育家系和对照群体之间的差异表达基因主要富集在吞噬作用、PUFA代谢、Toll和Imd信号通路、泛素化、CYP450介导的外源物质代谢等通路,均为华贵栉孔扇贝免疫系统或能量代谢系统的组成部分。最终筛选获得数个与华贵栉孔扇贝免疫相关的候选基因如BAG3、CYP450、HSP70、IFI27、TNFSF10、LZ、E3、Apo D等;3.BAG3基因的克隆与功能验证:Bcl-2相关抗凋亡基因3（BAG3）是BAG家族的重要成员,是一种进化上高度保守的多功能蛋白。华贵栉孔扇贝CnBAG3基因cDNA全长4,667 bp,其ORF长度为1,626 bp,编码541个氨基酸。该蛋白N端为WW结构域,C端为保守的BAG结构域,可与HSP70的ATP酶结构域相互作用。该基因在华贵栉孔扇贝的各组织中均有表达,其中肠道和性腺中的表达量极显著高于其它组织（P＜0.01）。在机体受到弧菌侵染后,CnBAG3表达量显著上调,促进自噬的发生,以提高机体的存活率。综上,本研究共构建了8个选育家系和1个对照群体,其中有3个家系养殖到成贝阶段,并且家系#4在抗病和生长方面均表现出显著的优势;筛选出十余个与免疫相关的候选基因;克隆获得CnBAG3基因,其主要功能为促进细胞自噬。本研究首次在华贵栉孔扇贝中开展抗病家系的选育工作,研究结果能够为华贵栉孔扇贝抗病新品种的培育及免疫研究提供基础数据和理论指导。
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