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附子是为毛莨科植物乌头的子根，具有回阳救逆、补火助阳之功效，在《神农本草经》中被誉为“回阳救逆第一品药”。因其具有良好的强心、抗炎、抗肿瘤等药理活性，临床常用于低血压，冠心病、风心病等疾病的治疗，但毒性极强，误食或用药不慎则可发生中毒，其毒性主要是对神经和心脏的损害，心脏毒性常表现为室性心律失常，其主要成分乌头碱(Aconitine)被广泛用于建立心律失常动物模型，但对其致心律失常的机制有待探讨。部分学者认为与其兴奋迷走神经，抑制窦房结正位起搏点节律，减慢房室传导有关；也有部分学者认为可能与其直接激活心肌钠通道、钙通道，诱发异位节律有关，而对于在心肌复极化过程中起重要调节作用hERG通道是否有影响未见报道。
hERG基因编码延迟整流钾通道的α亚基，与minK编码的β亚基及minK相关蛋白(minKrelatedprotein，MiRP1)共同组成快速激活延迟整流钾通道(rapidlyactivatingcomponentofdelayedrectifierpotassiumcurrent，Ikr)。Ikr是心室肌细胞动作电位3相快速复极的主要外向钾电流，该外向电流的减少或消失，会导致心肌细胞的复极化过程减慢，在体表心电图上表现为QT间期延长，动作电位时程延长。越来越多的临床研究表明许多药物包括抗组胺药、抗生素、抗抑郁药、抗精神病药物、抗疟药等引起的心血管不良反应与抑制hERG钾通道有关，hERG钾通道被抑制，导致QT间期延长，容易诱发端扭转性室性心律失常(TdP)、室颤甚至发生猝死。
本课题首次采用十二指肠给药的方法，观察中药附子水煎液对Beagle犬心电图的影响，并在出现明显室性心律失常时取血，制备含药血清。借助血清药理学和电生理学的研究方法，观察了含药血清对稳态表达hERG通道电流的影响，分析了附子中主要毒性成分乌头碱(Aconitine)对hERG通道电流的调节作用，发现乌头碱可以浓度依赖性（IC50为20μM）、电压依赖性影响hERG通道电流，因此，乌头碱(AC)可能通过抑制hERG钾通道而产生致心律失常的毒性反应。进一步研究发现，1mM的Aconitine对Kir2.1和Kir2.3电流没有明显的影响，0.1μM的Aconitine却能引起心肌细胞内钙明显升高。因此推测hERG通道并不是其敏感的毒性作用靶点，Aconitine只有在较高的浓度才有可能通过抑制hERG通道导致QT间期延长而诱发室性心律失常。
一、hERG电流的稳态表达与验证目的：建立稳定表达hERG钾通道的HEK293细胞株，为下一步研究药物对hERG通道的作用做好准备。
方法：(1)用Lipofectin2000转染试剂将hERG基因转染到HEK293细胞，再用抗生素G418筛选，形成单克隆细胞株，再进行培养、传代，建立稳定表达hERG钾通道的HEK293细胞株。(2)在稳态表达的HEK293细胞上全细胞膜片钳记录hERG电流，给予一些阳性对照药后观察hERG电流的变化，绘制量-效关系曲线用Hill方程拟合得到药物抑制hERG电流50％的浓度IC50，与文献报道的结果进行对比验证。
结果：(1)抗生素G418筛选，4周后得到阳性克隆，荧光显微镜下可见HEK293-hERG细胞发出绿色荧光。(2)全细胞膜片钳记录hERG电流，hERG通道在-50mV开始激活，至0mV左右电流达到最大，然后电流逐渐减小，hERG通道电流表现出明显的内向整流特性，V1/2和斜率因子分别为-13.6±4.1mV和8.4±2.0，与hERG通道电生理特征一致。(3)将电压钳制在-80mV，然后去极化至0mV，维持Ss，再复极至-50mV，维持4s，分别给予不同浓度的阳性对照药灌流，记录hERG电流。绘制量效关系曲线用hill方程拟合，得到Quinidine抑制hERG电流的IC50为0.35μmol/L;Astemizole抑制hERG电流的IC50为0.84nmol/L；Imipramine抑制hERG电流的IC50为5.5μmol/L;E-4031抑制hERG电流的IC50为10.3nmol/L;Disopyramide抑制hERG电流的IC50为20μmol/L。
结论：(1)hERG基因稳定表达于HEK293细胞；(2)记录到的电流符合hERG通道电生理特征；(3)工具药Quinidine，Astemizole，Imipramine,E-4031及Disoprymine对抑制hERG电流的IC50的数值与文献报道的结果基本一致，说明研究系统可靠。
二、附子的含药血清对hERG通道电流的影响目的：研究中药附子致心律失常作用，并分析药物血清对hERG通道电流的影响。
方法：(1)Beagle犬麻醉后十二指肠给予附子的水煎煮液10ml/Kg，观察给药后不同时间ECG的变化，并在出现多发性室速或TdP时取血，分离血清。(2)在稳转hERG通道蛋白的HEK293细胞上，全细胞膜片钳记录通道电流，给予附子的含药血清，观察hERG电流的变化。
结果：(1)Beagle犬经十二指肠给药，ECG监测可见QT间期明显延长、室性早搏、之后出现典型的室性心律失常。(2)将含药血清和不含药的血清（空白血清）稀释100倍后灌流，发现空白血清和含药血清均导致hERG尾电流减小，电流率分别为正常外液的91.0±8.6％和75.8±12.7％，经统计分析：含药血清与空白血清对电流的抑制有显著性差异(n=7，p＜0.05)。(3)用给药前的最大稳态激活电流标准化给药后的稳态激活电流，比较电流-电压关系曲线，发现在20mv左右含药血清对hERG通道电流抑制最明显。(4)应用稀释100倍的含药血清后V1/2由给药前的-5.3±0.3mV增大为-1.5±0.4mV(n=4，p＞0.05)。
结论：(1)Beagle犬经十二指肠给予附子水煎液，折合生药量20g/kg体重，出现明显的心律失常反应；(2)含药血清对hERG电流具有明显的抑制作用；(3)这种抑制作用不影响通道激活的V1/2，提示附子致心律失常作用可能与hERG电流抑制有关。
三、乌头碱对hERG通道电流及心肌细胞内钙的影响目的：研究乌头碱对hERG钾通道、Kir2.1、Kir2.3钾通道以及细胞内钙的作用。
方法：(1)在稳转hERG通道的HEK293细胞上，采用不同的刺激方案，全细胞膜片钳方式记录hERG通道电流，给予不同浓度的乌头碱溶液，观察给药前后hERG电流的变化情况；(2)在表达Kir2.1和Kir2.3的爪蟾卵母细胞上，给予不同浓度的乌头碱，观察其对Kir2.1和Kir2.3通道电流的影响；(3)在急性分离的豚鼠心室肌细胞上，给予不同浓度的乌头碱，观察细胞内钙浓度的变化。
结果：(1)分别给予乌头碱0.1、1、10、100和1000μM后，hERG尾电流与给药前相比电流率分别为：89.8±6.0％(n=5)，78.1±8.2％(n=5)，63.7±8.2％(n=7)，36.6±10.9％(n=7)和7.0±2.0％(n=4)，Hill拟合量效关系曲线得到乌头碱抑制hERG电流的IC50为20μM。(2)乌头碱1000μM明显抑制hERG尾电流，冲洗5～10min后可恢复45±5％。(3)在不同的钳制电压下观察乌头碱对hERG电流抑制情况，100μM浓度下hERG通道激活的Istep、Itail电流呈电压依赖性抑制，在20mv左右抑制达到最大，Itail电流率为55±3.2％。，通道V1/2和斜率因子无显著性变化(n=8，p＞0.05)。(4)改变去极化的不同时程记录通道激活达到稳态的时间常数，药前为323±30ms，药后257±36ms(n=5,p＞0.05)。(5)给予1mM乌头碱后Kir2.3通道电流变为给药前的97.2±3.1％,Kir2.1通道电流变为给药前的100.3±2.4％。(6)0.1μM乌头碱就能明显增强细胞内钙离子的荧光强度。
结论：乌头碱对hERG尾电流的抑制作用具有剂量依赖性和电压依赖性，抑制的IC50为20μM，20mV时抑制效应达到最大，对通道V1/2和激活时程没有显著影响。对Kir2.1和Kir2.3通道电流没有影响，但0.1μM浓度能明显升高心室肌细胞内钙。