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目的:RIP1K(receptor interacting protein 1 kinase,受体相互作用蛋白 1 激酶)是程序性坏死过程中的重要蛋白。前期研究结果表明,RIP1K基因沉默能够抑制脑缺血后反应性星形胶质细胞增生及胶质瘢痕的形成,且其机制可能与VEGFD(vascular endothelial growth factor D,血管内皮生长因子 D)-VEGFR3(vascular endothelial growth factor receptor 3,血管内皮生长因子受体3)通路有关。因此,本课题进一步研究RIP1K是否通过调节VEGFD基因,激活VEGFD-VEGFR3通路而参与调节缺血性脑卒中后胶质瘢痕形成;抑制RIP1K产生的减少胶质瘢痕形成的作用不依赖其神经保护作用;及其下游通路VEGFD-VEGFR3在缺血性脑卒中后胶质瘢痕形成中的作用。方法:在体内建立短暂性大脑中动脉阻塞(transient middle cerebral artery occlusion,tMCAO)模型,体外建立氧糖剥夺/再复氧(oxygen-glucose deprivation and reoxygenation,OGD/Re)模型进行研究。通过RIP1K慢病毒转染敲低RIP1K,或用RIP1K磷酸化激活特异性抑制剂Nec-1(Necrostatin-1)抑制RIP1K的磷酸化激活。使用VEGFR3抑制剂 Axitinib及VEGFR3特异性抑制剂SAR131675抑制VEGFR3的活性。EdU染色标记OGD/Re处理后新增的星形胶质细胞。通过免疫组织化学检测大鼠脑缺血/再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)后胶质瘢痕标志蛋白GFAP(glial fibrillary acidic protein,胶质纤维酸性蛋白)、neurocan、phosphacan 的表达及 RIP1K的敲低情况。通过免疫荧光检测OGD/Re后星形胶质细胞中胶质瘢痕标志蛋白neurocan、phosphacan的表达。Western Blotting用于检测体内及体外实验中GFAP、neurocan、phosphacan、VEGFD及VEGFR3的表达水平变化。基因芯片用于检测RIP1K基因沉默对于VEGFD基因Figf表达的影响。含VEGFD重组蛋白(400ng/ml)的培养基用于诱导原代星形胶质细胞中胶质瘢痕的形成。乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)漏出率用于评价星形胶质细胞OGD/Re后细胞损伤情况。通过星形胶质细胞-神经元共培养实验检测神经元在OGD/Re诱导的星形胶质细胞中突触延伸情况。结果:(1)通过免疫组织化学验证大鼠大脑皮层中RIP1K基因沉默成功。RIP1K在tMCAO诱导的大鼠大脑皮层反应性星形胶质细胞及胶质瘢痕中表达增加,RIP1K基因沉默可以减少tMCAO诱导的大鼠大脑皮层胶质瘢痕标志蛋白GFAP、neurocan、phosphacan的表达。EdU染色实验结果显示,RIP1K基因沉默可抑制OGD/Re诱导的反应性星形胶质细胞的增生。星形胶质细胞-神经元共培养结果显示RIP1K基因沉默有助于OGD/Re后反应性星形胶质细胞中神经元突触的延伸。(2)tMCAO 1天后开始给予Nec-1,连续7天或14天,能够分别明显减少tMCAO诱导的大鼠大脑皮层胶质瘢痕标志蛋白GFAP、neurocan、phosphacan的表达及胶质瘢痕的厚度。(3)通过基因芯片检测发现,RIP1K基因沉默后,VEGFD基因Figf的表达受到抑制。且再复氧阶段给予Nec-1能够减少OGD/Re诱导的星形胶质细胞中VEGFD的表达。(4)进一步研究发现,VEGFD及VEGFR3在tMCAO诱导的大鼠大脑皮层梗死边缘区中的表达与胶质瘢痕标志蛋白GFAP、neurocan、phosphacan的表达都呈现递增趋势,且共定位现象明显。通过标记神经元(Map-2)和VEGFR3发现,VEGFR3与神经元的共定位不明显。(5)VEGFD重组蛋白(400ng/ml)诱导原代星形胶质细胞中胶质瘢痕的形成。VEGFR3的抑制剂能够抑制tMCAO诱导的大鼠大脑皮层胶质瘢痕及OGD/Re诱导的反应性星形胶质细胞中胶质瘢痕的形成。Axitinib能够减少小鼠脑缺血急性期脑梗死体积,改善行为学症状。SAR131675减少OGD/Re诱导的反应性星形胶质细胞中LDH漏出率。结论:(1)RIP1K在tMCAO诱导的大鼠大脑皮层反应性星形胶质细胞中上调。(2)RIP1K通过调节VEGFD基因,激活VEGFD-VEGFR3通路而促进脑缺血后反应性星形胶质细胞的增生及胶质瘢痕的形成。(3)RIP1K基因沉默或Nec-1延迟给药均可抑制脑缺血后反应性星形胶质细胞的增生及胶质瘢痕的形成,促进神经元轴突的延伸。(4)抑制VEGFR3-VEGFD信号通路能够抑制脑缺血后反应性星形胶质细胞增生及胶质瘢痕的形成。