原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC,以下简称肝癌)是严重威胁人类健康的恶性肿瘤之一,其死亡率高居恶性肿瘤的第二位。中国是肝癌高发地区,其发病率占全球肝癌病人的50%以上。目前,手术治疗仍是肝癌首选和最有效的治疗方法,但由于肝癌病情隐匿、潜伏期长、肿瘤生长迅速,超过80%肝癌患者在确诊时已达晚期或发生转移而无法进行手术治疗,研究数据表明中国肝癌的5年相对生存率仅为10.1%。化疗仍然是临床上治疗肝癌的主要方法之一。传统的化疗药物并不能有效改善患者的预后,分子靶向药物的出现为肝细胞癌的治疗提供了新的治疗手段。索拉非尼是一种多靶点激酶抑制剂。欧美和亚太地区的两项随机、双盲的国际多中心Ⅲ期临床试验均证实索拉非尼可显著延长晚期肝癌患者的总生存期。基于以上临床试验结果,索拉非尼于2007年被美国食品药物管理局(FDA)批准用于晚期肝癌患者,并被多个指南推荐为晚期肝癌患者的标准一线用药。索拉非尼在临床上的应用主要为口服片剂,推荐剂量为800 mg每天,但由于胃肠道刺激(包括胃出血)、腹泻、高血压等不良反应的出现,常常导致剂量降低甚至治疗中止。因此,提高药物靶向性、降低治疗的毒副作用成为目前肝癌治疗的挑战。近年来,纳米药物的兴起为改善肝癌临床诊疗困难的现状带来了新的机遇。脂质纳米混悬剂(LNS)是纳米给药系统中一个很有发展前途的分支,有以下独特的优势：①选用可注射用磷脂作为稳定剂,有更好的生物相容性和安全性；②载药量高,无药物泄露问题,解决了诸多纳米载体载药量低,药物易泄露的问题,尤其适用于索拉非尼这种剂量大的难溶性药物；③索拉非尼具有强亲脂性(10g P=3.8),以磷脂为稳定剂保证了稳定剂与药物的相容性。④可利用增强渗透与滞留效应(EPR effect)增加药物在肿瘤部位的蓄积,在增强抗肿瘤作用的同时降低药物对正常组织的毒副作用。本文首次制备索拉非尼脂质纳米混悬剂(sorafenib-LNS)作为静脉注射制剂,以期望达到增强抗肿瘤效果,降低毒副作用的目的。本课题主要研究内容与结果如下：1.索拉非尼脂质纳米混悬剂中药物含量测定方法的建立采用高效液相色谱法对sorafenib-LNS中索拉非尼的含量进行测定,并考察其方法学。结果表明,此含量测定方法专属性强、灵敏度好、精确度高、能准确测定索拉非尼的含量。2.索拉非尼脂质纳米混悬剂及冻干制剂的制备及体外性质评价首先,采用纳米沉淀法制备sorafenib-LNS,利用单因素考察和正交设计对处方工艺进行优化,并对最优处方进行物理化学性质考察,包括粒径及其分布、zeta电位、外观形态、载药量等。为进一步提高制剂稳定性,在混悬剂中加入甘露糖(5%,W/V)作为冻干保护剂制备索拉非尼脂质纳米混悬剂冻干制剂(lyophilized sorafenib-LNS)。然后,采用动态膜透析法以磷酸盐缓冲液(pH=7.4,1%吐温-80)为释放介质,在37℃恒温振荡箱中以100 rpm的转速进行释放行为的考察。此外,以人原发性肝细胞癌细胞(HepG2)与人肝癌细胞(Be1-7402)为细胞模型,利用MTT法考察sorafenib-LNS的体外细胞毒性。最后,对sorafenib-LNS的体外溶血性进行考察。结果表明,sorafenib-LNS呈类球形,粒径分布均匀,其三批重现的平均粒径为(164.5±4.5)nm,多分散系数(polydispersity index, PDI)为0.202±0.015,zeta电位为(11.0±0.2)mV,载药量为10.55％±0.16％。 lyophilized sorafenib-LNS呈疏松多孔状态,再分散性良好,且初步稳定性试验证明在4℃、-20℃条件下放置6个月,冻干制剂的外观无明显变化。此外,体外释放结果表明sorafenib-LNS开始的10 h内释放较快,在随后的38 h内缓慢释放；MTT结果显示,索拉非尼增溶溶液及sorafenib-LNS对肝癌细胞的毒性作用呈浓度依赖性。索拉非尼增溶溶液组与索拉非尼脂质纳米混悬剂的细胞生存率没有显著差别(p>0.05)。当浓度大于5 μM时,细胞与索拉非尼脂质纳米混悬剂孵育后,细胞生存率明显低于索拉非尼增溶溶液(p<0.01)。与索拉非尼增溶溶液组相比,索拉非尼脂质纳米混悬剂在HepG2细胞和Bel-7402细胞的IC50值显著降低(HepG2:3.39 μM versus 8.61 μM; Bel-7402:2.65μM versus 10.01 μM) (p< 0.01),表明sorafenib-LNS对两种肝癌细胞的抑制作用明显强于索拉非尼增溶溶液组,在细胞水平上验证了LNS能够增强药物的抗肿瘤效果。溶血实验结果证明在此实验条件下索拉非尼脂质纳米混悬剂未发生明显溶血现象。3.索拉非尼脂质纳米混悬剂体内药效学、组织分布及体内刺激性研究本文以H22荷瘤昆明小鼠为动物模型,以索拉非尼增溶溶液为阳性对照,HPLC法测定sorafenib-LNS与索拉非尼增溶溶液静注后在小鼠体内各组织及肿瘤部位的浓度,以考察药物的体内分布,并通过靶向性参数对制剂靶向性进行评价。为更科学直观地观察制剂对对药物分布的影响,本文采用近红外荧光成像技术,并选用与索拉非尼性质相近的近红外荧光染料DiR碘化物,进一步评价不同制剂静注后在小鼠各组织的蓄积情况。此外,本课题还对sorafenib-LNS的体内抗肿瘤活性、组织切片和血管刺激性进行考察。结果表明,与索拉非尼增溶溶液组相比,索拉非尼脂质纳米混悬剂组在瘤组织内的药物浓度明显增加(p<0.01)。索拉非尼在肿瘤部位的总靶向效率Te由索拉非尼增溶溶液组的5.96%提高到7.28%(1.22倍),其相对摄取率re和瘤内峰浓度Ce分别为2.26和1.67,证明索拉非尼脂质纳米混悬剂具有良好的瘤靶向效率。体内抗肿瘤结果表明,sorafenib-LNS组(9 mg/kg)荷瘤昆明小鼠的瘤体积明显小于索拉非尼增溶溶液静注组(9 mg/kg)(p<0.05)及双倍剂量的索拉非尼增溶溶液口服组(18 mg/kg) (p<0.05),具有最高肿瘤抑制率(83.44%),证明脂质纳米混悬剂可显著增强索拉非尼的抗肿瘤效果。组织切片实验及血管刺激性实验结果证明,在此实验条件下未产生明显的血管刺激性和组织毒性。综上所述,本课题开发的索拉非尼脂质纳米混悬剂形态圆整,粒径小且相对均匀,载药量高。在H22荷瘤昆明小鼠模型表现出一定的肿瘤靶向性,体内药效学结果显示出良好的肿瘤抑制作用,具有一定的研发前景。