论文部分内容阅读
背景和目的:脓毒症(sepsis)是由感染引起的失调性宿主反应,发病率以每年1.5%-9%的速度在增长,尽管随着医疗水平的不断进步,脓毒症的病死率仍高达20%-40%[1]。脓毒症的病理机制复杂,失调的炎症反应是脓毒症的病理生理基础。脓毒症患者易发生多器官功能障碍,而心脏是易受累的靶器官之一,研究显示,脓毒症患者中近40%-50%发生心肌抑制,7%发生心力衰竭[2]。故明确脓毒症所致心功能障碍的原因及机制,对于脓毒症的预防和治疗可以提供研究基础。1-磷酸鞘氨醇(S1P)作为机体内重要的脂质信号分子,与细胞表面5种G蛋白偶联型受体(S1P1-S1P5)相结合,从而发挥不同的生物学功能。因其受体在机体各系统广泛分布,既往研究表明,S1P与脓毒症、冠心病、中风等多种疾病的病理生理过程相关。FTY720结构与S1P类似,可与除S1P2受体之外的四种受体即S1P1、S1P3、S1P4、S1P5受体相结合,被用于自身免疫疾病、炎症、器官移植排斥反应等疾病的治疗[3],但其对脓毒症心肌细胞自分泌的影响研究较少,因此,本研究予以不同浓度的FTY720干预体外培养的脓毒症心肌细胞,通过检测相关炎性细胞因子以及蛋白表达的变化,旨在阐明S1P对脓毒症心肌细胞的保护性作用及可能的机制。实验方法:1、大鼠心肌细胞株H9C2的培养:DMEM高糖培养基+10%胎牛血清,37℃、5%C02细胞培养箱中培养,细胞为贴壁细胞。2、LPS对心肌细胞炎性细胞因子分泌的影响:用不同浓度(0、1、2、5、10μ g/ml)的LPS分别攻击心肌细胞8h、12h、24h、36h、48h,收集细胞上清,离心后测定细胞培养液上清中IL-6、IL-10的水平。3、心肌细胞炎症反应通路测定:采用同一浓度(5 μ g/ml)的LPS刺激心肌细胞0h、8h、12h、24h、36h、48h,提取细胞总蛋白,采用Western blot技术检测心肌细胞P-I κ B α蛋白的表达变化。4、LPS对心肌细胞凋亡及增殖的影响:方法同3,采用Western blot技术检测心肌细胞cleaved-caspase3、AKT蛋白的表达变化。5、不同浓度的FTY720干预后细胞因子分泌的变化:将心肌细胞分为以下六组,空白对照组、LPS(5 μg/ml)组、FTY720(10nM)+LPS(5 μ g/ml)组、FTY720(50nM)+LPS(5 μ g/ml)组、FTY720(100nM)+LPS(5 μ g/ml)组、FTY720(200nM)+LPS(5 μg/ml)组,干预24h后收集细胞上清,采用ELISA法测定上清中IL-6、IL-10的浓度。6、FTY720干预后对炎症反应通路及凋亡蛋白的影响:心肌细胞分组同5,提取细胞蛋白,使用Western Blot方法检测各组细胞P-I κ B α、cleaved-caspase3、AKT蛋白的表达变化。7、选择性S1P1,3受体的抑制剂VPC23019和AKT激酶的抑制剂wortmanin对AKT蛋白表达的影响:将心肌细胞分为两大组:LPS组、LPS+FTY720(100 nM)、LPS+FTY720(100 nM)+VPC23019 组、LPS+VPC23019 组以及 LPS 组、LPS+FTY720(100 nM)、LPS+FTY720(100 nM)+wortmanin 组、LPS+wortmanin组,采用Western Blot方法检测心肌细胞AKT蛋白的表达变化。结果:1、LPS可影响心肌细胞IL-6、TNF-α及IL-10的分泌:LPS能够刺激心肌细胞分泌炎性细胞因子IL-6和IL-10,分泌量与LPS浓度呈依赖性表达升高,IL-6分泌水平在36h达到高峰,IL-10的分泌无明显时间梯度关系。2、LPS可影响心肌细胞P-IκBα蛋白的表达:Western Blot结果显示,LPS(5 μ g/ml)刺激心肌细胞,可使胞浆中P-I κ B α表达水平增高,于24小时达到高峰,与空白对照组相比具有统计学差异(P<0.05)。3、LPS可影响心肌细胞cleaved-caspase3表达及AKT表达:LPS(5 μ g/ml)刺激心肌细胞,与空白对照组相比,cleaved-caspase3蛋白表达增加,在12h表达量最高;AKT在8h表达量最低,48h升高。4、FTY720干预可影响细胞因子IL-6的分泌:FTY720在浓度为50nM、100nM、200nM 时,分泌的 IL-6 与 LPS 组相比下降(96.5±7.7,71.1±8.3,56.1±7.2 vs 146±13.7),差异具有统计学意义(P<0.05);而IL-10在各组中的水平分别为:9.8±0.9pg/ml、21.7±2.8pg/ml、20.9±1.9pg/ml、19.5土 1.8pg/ml、21.2±2.2pg/ml和18.9士2.4pg/ml,FTY720对脓毒症心肌细胞IL-10的分泌未观察到明显影响。5、FTY720可影响心肌细胞胞浆中IκBα磷酸化:与LPS组相比,50nM、100nM、200nM浓度的FTY720干预可使P-Iκ B α表达分别降低62%、98%、189%。6、FTY720可英雄LPS诱导的心肌细胞凋亡,以及细胞的存活:50nM、100nM、200nM 浓度的 FTY720 可使 cleaved-caspase3 表达量分别降低 95%、123%、66%,FTY720 干预浓度为 100nM、200nM 时,与 LPS 组相比,AKT 的表达分别增加了 100%、167%。7、选择性S1P1,3受体的抑制剂VPC23019和AKT激酶的抑制剂wortmanin可抑制AKT蛋白表达:VPC23019及wortmanin均可使AKT表达减少,FTY720通过S1P1,3途径激活AKT通路。结论:1、LPS可通过NF-κ B信号通路引起体外培养大鼠心肌细胞炎性细胞因子TNF-α、IL-6的分泌增加,且对其分泌呈时间及浓度依赖性,LPS可以引起IL-10的分泌增加,但仅有浓度依赖性而无时间依赖性。LPS可以刺激凋亡蛋白cleaved-caspase3表达增加,增殖蛋白AKT的表达减少。2、FTY720可抑制IκBα磷酸化,减少炎性细胞因子IL-6的分泌;降低cleaved-caspase3表达的同时,增加了 AKT的表达,且是通过S1P1,3途径激活AKT通路。FTY720通过影响脓毒症心肌细胞的自分泌,起到抗炎、抗凋亡、促存活的保护性作用。