赤霉病主要是由禾谷镰刀菌属引起的,能够破坏几乎所有的主要谷类作物,特别是小麦,使我国小麦严重减产,对我国粮食生产和食品加工方面造成严重影响。然而,目前在高抗品种的选育方面并未取得良好的进展。因此,挖掘和研究小麦抗赤霉病基因,对于提高小麦对抗赤霉病的抵御力和解析其中的抗赤霉病基因生长反应机制具有十分重要的意义。据前人研究发现,PFT(pore-forming toxin-like)(Ta PFT)基因是位于Fhb1位点上的抗性基因,但PFT的抗性机理并不清楚。本实验室前期利用PFT为诱饵蛋白筛选小麦酵母双杂文库后得到候选互作基因TaRBL(ricin-B-like lectin),TaRBL编码篦麻毒素类凝集素。本研究通过在小麦品种苏麦3号中克隆得到TaRBL基因,构建酵母表达载体和双分子荧光互补载体验证TaRBL基因与Ta PFT基因互作,利用VIGS技术在小麦中对TaRBL基因进行初步功能验证,分析TaRBL基因在小麦抗赤霉病过程中的抗病机理。主要研究结果如下:1.利用文库插入序列在小麦基因组网站比对获得TaRBL全长编码区(CDS)序列,设计特异引物,利用苏麦3号cDNA通过PCR扩增得到了TaRBL基因CDS全长,经过序列分析表明该基因CDS全长为1023 bp,编码含有340个氨基酸的蓖麻毒素类凝集素蛋白。2.构建酵母表达载体对TaRBL基因与Ta PFT基因进行互作验证,结果显示该基因与Ta PFT基因在酵母中能够发生互作。构建双分子荧光互补载体在烟草中进一步验证互作关系,结果显示该基因与Ta PFT基因能够在烟草细胞中发生互作。这些结果表明TaRBL基因与Ta PFT基因在植物体外和体内均存在互作。3.通过对抗病品种苏麦3号和感病品种济麦22接种禾谷镰刀菌孢子,然后对接种的小麦TaRBL基因进行实时荧光定量分析,检测该基因在各个时间点的相对表达量,结果显示TaRBL基因受禾谷镰刀菌诱导后在抗病品种苏麦3号中上调表达,在感病品种济麦22中下调表达,表明TaRBL基因表达受赤霉病诱导,且其表达量与赤霉病抗性呈正相关。4.分别以抗病品种苏麦3号和感病品种济麦22为材料,利用BSMV-VIGS技术于穗期对TaRBL基因进行沉默,并接种禾谷镰刀菌鉴定沉默植株的抗性变化。结果显示沉默抗病品种苏麦3号的TaRBL基因后,导致其赤霉病抗性显著降低;沉默感病品种济麦22的TaRBL基因后,导致其明显更感病,抗性进一步降低。这些结果表明TaRBL基因沉默会降低小麦赤霉病抗性。5.构建TaRBL基因过表达载体,利用农杆菌介导法对感病小麦济麦22进行遗传转化,通过GUS染色和PCR扩增等方法鉴定转基因阳性植株。进一步通过离体叶片接种赤霉病孢子悬浮液方法对转基因阳性植株进行赤霉病抗性鉴定后显示TaRBL过表达小麦的赤霉病抗性显著提高,表明TaRBL为小麦赤霉病抗性基因。综上,本文克隆了TaRBL基因全长,生物信息学分析显示其编码蛋白为篦麻毒素类凝集素。通过不同抗感品种接种禾谷镰刀菌后的基因定量研究和VIGS技术对基因进行功能分析后表明该基因具有正调控的抗赤霉病作用。进一步通过构建过表达载体转小麦获得阳性转基因植株,并对其通过离体叶片进行赤霉病抗性鉴定后发现TaRBL过表达小麦的赤霉病抗性显著提高,证明TaRBL为小麦赤霉病抗性基因。该研究结果为培育新的抗病品种提供了基因基础和理论依据,对于解析小麦抗赤霉病机制提供新途径。