【摘 要】
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背景和目的病原体核酸检测在临床诊断和治疗中起着至关重要的作用。病原体培养需要较长的时间和复杂的操作,而基于核酸的检测方法更有利于提供多种感染信息。例如,人乳头瘤病毒（Human Papilloma Virus,HPV）基因检测对于宫颈癌筛查至关重要。世界上存在200多种HPV亚型,其中约15种高危型HPV亚型可以致癌,构建可以识别临床样本中HPV亚型的即时核酸检测方法对疾病监测和治疗非常重要。聚合
【基金项目】
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国家自然科学基金（82072382）； 国家自然科学基金（82272424）； 国家杰出青年科学基金（82025024）； 国家重点研发项目（2021YFA1300604）；
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背景和目的病原体核酸检测在临床诊断和治疗中起着至关重要的作用。病原体培养需要较长的时间和复杂的操作,而基于核酸的检测方法更有利于提供多种感染信息。例如,人乳头瘤病毒（Human Papilloma Virus,HPV）基因检测对于宫颈癌筛查至关重要。世界上存在200多种HPV亚型,其中约15种高危型HPV亚型可以致癌,构建可以识别临床样本中HPV亚型的即时核酸检测方法对疾病监测和治疗非常重要。聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction,PCR）是最常用的病原体核酸检测方法,但它的实用性受到设备昂贵、操作繁琐、场地要求高等限制。虽然已提出了多种无需特定设备的等温扩增方法,但是这些方法都有其自身的缺陷。例如,环介导等温扩增（Loop-mediated Isothermal Amplification,LAMP）对引物设计和操作人员的要求高,且容易产生假阳性结果。因此,迫切需要开发一种简单、灵敏、特异的病原体核酸检测方法。研究方法1.基于立足点介导链置换启动引物交换反应的检测方法的构建与表征1.1设计合成引物交换反应所需的各种引物序列。1.2通过电泳、荧光光谱法对引物序列组装产物与扩增产物进行表征,验证该检测方法的可行性。1.3将本检测方法采取一步法进行检测,验证本方法采用一步法检测的可行性。1.4对反应的温度、时间、引物长度、DNA聚合酶浓度进行优化,得到最佳反应条件。2.对构建的检测方法进行性能评价与临床应用能力评估2.1在最佳反应条件下,检测不同浓度靶标产生的荧光信号,计算出线性范围和检测限,评价本方法的分析灵敏度。2.2用本方法对多种靶标进行检测,评价本方法的特异性。2.3比较针对三个不同位点的HPV-16靶标的检测体系的检测效能,验证靶标选择的重要性。2.4用本方法同时对试剂盒提取DNA和热裂解标本进行检测,评价本方法对热裂解方法的适用性。2.5用本方法检测临床标本,并与PCR方法进行比较,评价本方法的临床检测性能。结 果与传统的聚合酶链反应和等温扩增技术相比,本方法更简单、快捷。通过引入立足点介导的链置换反应来提高检测特异性,结合引物交换反应（Primer Exchange Reaction,PER）强大的信号放大能力,实现高特异性和高灵敏度检测。经过优化后反应体系的DNA聚合酶浓度为0.2 U/μL、引物长度为10 nt,可在37℃恒定温度1小时内达到18 fM的检测限,同时适用于热裂解标本,进一步减少操作步骤和检测时间。通过24个宫颈脱落细胞标本、30个血浆标本、10个尿液标本验证了该体系的临床应用能力。本方法操作简单、成本低廉,具有广泛的适用性,并且很容易与目前市场上成熟设备集成一体化,实现病原体核酸即时检验（Point-of-Care Testing,POCT）。
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