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抗菌肽,是生物机体为防御外界病原微生物入侵产生的一类小分子多肽。对细菌、一些真菌以及病毒和肿瘤细胞都表现出显著的抑制作用。抗菌肽易溶于水、热稳定性好、在强酸强碱条件仍有抑菌活性。这些优点决定了其在食品、农业等领域上有着广阔的应用前景。一般获取抗菌肽的方法主要有:直接从生物体中提取分离、化学合成和基因工程技术人工表达。其中利用基因工程技术合成的抗菌肽,活性高,理化性好,生产成本低,产量高,因此被广泛应用。杂合抗菌肽,是将不同抗菌肽片段利用基因工程技术连接,形成生物活性更强的新型抗菌肽。构建杂合抗菌肽是通过改变天然抗菌肽的内部结构和理化性质,克服天然抗菌肽的缺点,集各个抗菌肽的优点与一体,成为目前研究的热点。本研究将删除四个半胱氨酸(C)的鲎素抗菌肽Polyphemusin I和Spinigerinα采用柔性链连接,再依据毕赤酵母偏爱密码子优化翻译Py和Py-Sα的氨基酸序列,利用Primer 5.0设计引物,采用聚合酶链式反应扩增抗菌肽Py和杂合肽Py-Sα基因。将扩增基因克隆、鉴定,并在毕赤酵母中表达,优化表达条件,分析表达产物的生物活性和理化特性。研究结果表明:成功构建pPICZαA-Py-Sα杂合抗菌肽基因。试剂盒提取后经PCR扩增验证pPICZαA-Py和pPICZαA-Py-Sα已成功整合到酵母基因组中。将重组酵母菌在含有甲醇的BMMY培养基上诱导表达,表达产物利用葡聚糖凝胶SephadexG-25脱盐层析分离提纯后通过蛋白质SDS-PAGE电泳,经检测约在3.4KD和9.5KD两处分别出现清晰的蛋白条带,且和预期蛋白大小相符。根据抗菌肽表达条件优化结果,抗菌肽Py的最佳诱导条件:诱导时间96h,诱导温度28℃,培养基初始pH值为6.0。在最优条件下,抗菌肽Py的表达蛋白的浓度可达1.10mg/mL。杂合肽Py-Sα诱导时间96h,诱导温度28℃,培养基初始pH值为6.5。在最优条件下,抗菌肽Py-Sα的表达蛋白的浓度可达1.25mg/mL。两种抗菌肽对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、和肠炎沙门氏菌都能表现出一定的抑菌效果。其中对大肠杆菌表现出的抑制作用最强。两种抗菌肽对E.coli、S.aureus和Salmonella的MIC值分别为30ug/mL、55 ug/mL、75 ug/mL和20ug/mL、35 ug/mL、55 ug/mL。杂合抗菌肽Py-Sα比抗菌肽Py的抑菌效果明显增强。在抗菌肽稳定性研究中发现两种抗菌肽有较好的耐热性、耐酸碱性和抗辐射作用,且在相同处理条件下,杂合肽的抑菌效果始终高于抗菌肽Py。将重组酵母菌传代10次后,进行PCR扩增验证,未发生目的基因的丢失现象,表达蛋白仍存在抑菌效果。综上所述,本研究成功完成真核表达载体pPICZαA-Py和pPICZαA-Py-Sα的构建,并在毕赤酵母中进行了诱导分泌表达。经验证表达蛋白产物有一定的生物活性,杂合抗菌肽的抑菌效果有所提高,为抗菌肽的进一步研究和应用奠定基础。