论文部分内容阅读
研究目的:通过观察胰高血糖素样肽-1(Glucagon-likepeptide-1,GLP-1)类似物利拉鲁肽(Liraglutide,LG)对代谢综合征(metabolic syndrome,MS)心肌缺血再灌注(Ischemia-reperfusion,I/R)损伤大鼠模型及高糖培养缺氧复氧心肌细胞的影响,探讨LG对MS各组分的改善及对心肌缺血再灌注损伤的保护作用及机制。1、LG对MS大鼠心肌缺血再灌注损伤保护及对自噬的影响4周龄SPF级雄性OLETF(otsuka long-evans tokushima fatty,OLETF)大鼠饲以高脂饲料建立MS模型。将MS大鼠分为假手术组(S组)、缺血再灌注+NS组(I/R+NS组)、缺血再灌注+LG组(I/R+LG组)、缺血再灌注+LG+CQ组(I/R+LG+CQ组)、缺血再灌注+CQ组(I/R+CQ组)。LG实验所用剂量为4mg/kg、腹腔注射,每日一次,连续应用8周。氯喹(Chloroquine,CQ)实验所用剂量为25mg/kg,每日一次,腹腔注射,连续应用8周。应用结扎前降支30min,再灌注120min的办法建立心肌缺血再灌注损伤模型。监测MS各组分,检测cTnT含量,应用电镜观察线粒体面积及自噬体,TTC染色观察心肌梗死面积,Wsestern blot检测自噬相关蛋白及自噬上游通路相关蛋白,进行心脏彩超查评价心功能,Masson染色观察心肌间质纤维情况。结果:24周MS组模型成功建立。应用LG后MS大鼠各代谢组分好转。I/R+LG组较I/R+NS组心肌梗死面积明显减小,CTnT水平下降,心脏彩超提示心功能改善,应用氯喹后心肌梗死面积增加,CTnT水平下降,心功能减低。I/R+LG组较I/R+NS组心肌细胞自噬水平提高,应用CQ后心肌细胞自噬水平下降。应用LG后AMPK/mTOR通路激活。2、LG对高糖培养缺氧复氧心肌细胞的保护作用及对自噬的影响采用新生乳鼠原代心肌细胞,应用CCK8试剂盒检测细胞存活率的办法确定LG最佳浓度,将细胞分为高糖对照组(control组);高糖缺氧复氧组(HH/R组);HH/R+LG组;HH/R+LG+CQ组;HH/R+CQ组;HH/R+LG+CC组;HH/R+CC组,此外为了排除渗透压对心肌细胞存活率的影响,设置了低糖H/R+甘露醇组(H/R+Mannitol)和低糖H/R组(H/R)。将LG在缺氧复氧前3小时加入。高糖浓度为50mmol/L,低糖浓度为5.5mmol/L,甘露醇浓度为44.5mmol/L。检测各组心肌细胞存活率。Wsestern blot检测自噬相关蛋白及自噬上游通路相关蛋白。GFP-mRFP-LC3腺病毒转染原代心肌细胞的方法观察自噬流的变化。结果:H/R+Mannitol组和NH/R组心肌细胞存活率无统计学差异,考虑渗透压对心肌细胞存活率无明显影响。根据细胞存活率结果确定中等浓度LG为最佳剂量。H/R组心肌细胞存活率高于HH/R组,H/R组自噬水平高于HH/R组。考虑高糖损害自噬,影响心肌存活率。HH/R+LG组心肌细胞存活率高于HH/R组,HH/R+LG组自噬水平高于HH/R组。加用自噬抑制剂后HH/R+LG+CQ组心肌细胞存活率明显低于HH/R+LG组。考虑LG提高自噬水平提高心肌细胞存活率。HH/R+LG组AMPK磷酸化水平高于HH/R组,HH/R+LG组mTOR磷酸化水平低于HH/R组,考虑LG激活了AMPK/mTOR通路,加用AMPK抑制剂CC后HH/R+LG+CC组较HH/R+LG组自噬水平下降,心肌细胞存活率下降。结论:1、本研究通过观察LG预处理高脂喂养OLETF大鼠建立的MS模型,发现LG明显改善了MS大鼠各代谢组分,对MS大鼠心肌缺血再灌注损伤具有保护作用,能提高心肌自噬水平,改善自噬流。2、体外培养高糖缺氧复氧乳鼠原代心肌细胞,给与LG预处理,并应用自噬抑制剂及AMPK抑制剂,相关结果提示LG通过激活AMPK/mTOR通路提高心肌细胞的自噬水平,改善自噬流,发挥心肌细胞保护作用。