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研究目的及研究背景原发性肝癌是指肝细胞或肝内胆管细胞发生的癌,是我国常见的恶性肿瘤之一。近年来,原发性肝癌的发病率在世界各地呈上升趋势。原发性肝癌分为肝细胞型、胆管细胞型和混合型。其中肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是最常见的原发性肝癌类型,是全球排名第五的癌症,在世界范围内每年约有100万到250万人死于HCC。HCC恶性程度高、进展迅速、预后差。近年来随着放化疗技术和外科手术水平的不断提高,HCC患者生存率得到了一定程度的提升,但尚不理想,转移和复发仍然是威胁HCC患者生命最主要的原因。MicroRNAs(miRNAs)是一类长度为19-22nt,进化上保守的小非编码RNA,成熟的miRNAs是由较长的初级转录物经过连续酶切获得,其对基因的转录翻译起负调控作用。越来越多的研究表明,miRNAs在细胞增殖、细胞周期停滞、细胞凋亡以及癌症的侵袭转移中发挥了重要作用。异常表达的miRNAs可以通过靶向相关信号分子,对HCC的发生发展起调控作用。miRNAs在不同的疾病和组织中有较好的特异性,有望成为癌症诊断和治疗的新靶标,为癌症的诊治提供新的思路。发育调节脑蛋白(Developmentally regulated brain protein,DBN1)又称为Drebrin,是高度保守的蛋白,特别是在含有肌动蛋白解聚因子同源结构域和肌动蛋白结合结构域的氨基末端(残基1-315)。DBN1首次报道是在神经元细胞中,越来越多的文献报道DBN1在多种非神经元细胞中也有表达,其主要位于富含肌动蛋白的伪足区域。细胞与细胞之间的连接和细胞伪足的形成在癌症的转移和侵袭中扮演着重要的角色,DBN1主要与细胞突起和细胞间连接相关,同时DBN1可与纤维形肌动蛋白(Fibrous Actin,F-actin)结合,而F-actin能够影响肿瘤细胞的运动能力,提示DBN1可能在癌症的转移和侵袭中发挥重要的作用。本研究旨在探讨miR-146b-3p和DBN1在HCC中的表达水平及其相关功能,探索DBN1/F-actin在HCC转移和侵袭中的作用机制,以期阐明miR-146b-3p和DBN1/F-actin在HCC侵袭转移中的作用及其机制。研究内容和方法本研究以GEO数据库中的HCC数据集、HCC临床样本、HCC细胞系和裸鼠为研究对象。首先,在GEO HCC数据集中筛选获得在HCC中低表达的miR-146b-3p,生存分析比较其表达量的高低对HCC预后的影响;同时利用Real-time PCR检测HCC临床样本中miR-146b-3p的表达水平,Transwell、Matrigel-Transwell、划痕愈合、CCK8和流式细胞术检测miR-146b-3p过表达对HCC细胞迁移、侵袭、增殖、凋亡和周期的影响,探讨miR-146b-3p在HCC中的作用。其次,根据miRNAs相关网站预测miR-146b-3p潜在靶基因(DBN1),Real-time PCR和Western blot检测过表达miR-146b-3p对DBN1的影响,并通过双荧光素酶报告基因法检测miR-146b-3p是否靶向抑制DBN1表达;在GEO HCC数据集中分析比较DBN1在HCC中的表达水平及其对肿瘤体积、转移、分期及预后等的影响;Transwell、Matrigel-Transwell、划痕愈合、CCK8和流式细胞术检测干扰DBN1对HCC细胞迁移、侵袭、增殖、凋亡和周期的影响;激光共聚焦和免疫共沉淀探索miR-146b-3p通过抑制DBN1的表达进而干扰DBN1与F-actin复合物的形成,调节细胞极化和伪足的形成,从而影响HCC的迁移和侵袭能力,探讨miR-146b-3p/DBN1在HCC侵袭转移中的作用和机制。最后,通过慢病毒包装建立LV-NC shRNA-HepG2和LV-DBN1 shRNA-HepG2稳定转染细胞株;裸鼠尾静脉注射模型,检测抑制DBN1对HepG2细胞在裸鼠体内的转移和侵袭能力的影响,主要探讨DBN1在HCC细胞的体内转移和侵袭中的作用。研究结果首先,在本研究中,生物信息学分析和临床标本检测发现miR-146b-3p在HCC中低表达,且其低表达与HCC的不良预后相关。CCK8、流式细胞术结果表明miR-146b-3p与HCC细胞的增殖、周期和凋亡无关;而Transwell、Matrigel-Transwell和划痕愈合结果表明miR-146b-3p的低表达促进HCC的侵袭转移。以上结果提示,miR-146b-3p与HCC的预后密切相关,且在HCC的侵袭转移中发挥重要作用。其次,根据miRNAs相关网站预测发现miR-146b-3p潜在靶基因DBN1,Real-time PCR和Western blot实验证实过表达miR-146b-3p可抑制DBN1的表达,但双荧光素酶报告基因实验表明miR-146b-3p不是直接靶向抑制DBN1。生物信息学分析发现,DBN1在HCC中高表达,其高表达与HCC的不良预后、分期和转移相关。基因集富集分析发现DBN1与细胞骨架蛋白相关基因富集有关,表明DBN1可能通过细胞骨架相关蛋白通路调节HCC。临床标本检测发现在HCC中miR-146b-3p和DBN1的表达呈负相关。CCK8、流式细胞术结果表明DBN1与HCC细胞的增殖、周期和凋亡无关;而Transwell、Matrigel-Transwell和划痕愈合结果表明DBN1的高表达促进HCC的侵袭转移。免疫共沉淀实验证实DBN1与F-actin结合,激光共聚焦实验发现过表达miR-146b-3p或抑制DBN1后,HepG2细胞极化减弱、丝状伪足收缩。以上结果表明,miR-146b-3p可抑制DBN1的表达,进而影响DBN1与F-actin的结合,抑制细胞的极化和丝状伪足的形成,最终降低HCC细胞的迁移和侵袭能力。最后,通过慢病毒包装实验成功构建LV-NC shRNA-HepG2和LV-DBN1 shRNA-HepG2稳定转染细胞株;裸鼠体内实验表明,与野生株相比,DBN1稳定干扰的HepG2细胞对小鼠肺组织的侵袭能力减弱,进一步验证了DBN1在HCC侵袭转移中发挥重要作用。结论1.miR-146b-3p在HCC癌组织和细胞系中低表达,其低表达促进了HCC的侵袭转移,并与HCC的预后相关;2.DBN1在HCC癌组织和细胞系中高表达,其高表达促进HCC的侵袭转移,并与HCC的分期和预后相关;3.在HCC中,miR-146b-3p可抑制DBN1的表达,影响DBN1与F-actin的结合,进而抑制细胞极化和丝状伪足的形成,最终降低HCC细胞的迁移和侵袭能力;4.在裸鼠体内,LV-DBN1 shRNA-HepG2细胞对肺组织的侵袭能力低于LV-NC shRNA-HepG2细胞,表明DBN1在HCC细胞的体内侵袭中发挥重要作用。