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研究背景和目的光动力学治疗（Photodynamictherapy,PDT）与化学治疗等传统的癌症治疗方法相比较,具有更好的选择性和较小的毒副作用等优点,因此,在治疗恶性实体瘤方面具有其独特的治疗优势。光敏剂作为光动力学治疗的关键,设计和研发具有良好效果的新型光敏剂一直是PDT研究领域的研究热点。本研究检测了新型卟啉烯衍生物TBPoS-2OH作为光敏剂在黑色素瘤PDT治疗中的抗肿瘤效果,并进一步探讨TBPoS-2OH在黑色素瘤PDT治疗中具体的分子作用机制。研究方法1、黑色素瘤A375和B16细胞经TBPoS-2OH处理并光照（λex=640±15 nm,6 J/cm2）后,采用四甲基偶氮唑盐（methylthiazolyltetrazolium,MTT）比色法检测在光照和黑暗环境下,TBPoS-2OH对两种黑色素瘤A375和B16细胞的毒性大小;并采用Calcein-AM/碘化丙啶（PI）双染法观察细胞的生存状态;然后,通过Hoechst 33258荧光染色法观察细胞核形态变化的情况,Annexin V-FITC/PI双染法测定A375和B16细胞的凋亡率。2、A375和B16细胞经TBPoS-2OH孵育不同时间（5、30、60和120 min）后,通过荧光显微镜检测TBPoS-2OH的红色荧光信号,来评价TBPoS-2OH在细胞A375和B16内的摄取情况;同时,利用激光共聚焦显微镜检测溶酶体探针Lyso-tracker Green或线粒体探针Mito-tracker Green FM与TBPoS-2OH的定位情况,来评估TBPoS-2OH在A375和B16细胞内的分布情况。3、A375和B16细胞经TBPoS-2OH处理并光照后,活性氧（ROS）检测试剂盒测定两种黑色素瘤细胞内ROS含量的变化;线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1法）检测A375和B16细胞线粒体膜电位的变化情况;进一步,采用蛋白质免疫印迹（western blot）法测定细胞内Bcl家族蛋白Bax、Bid和Bcl-2,胞质内细胞色素c（Cytochrome c,Cyto-c）、Apaf-1,以及 caspase 家族蛋白 caspase-3、caspase-9、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9和PARP家族蛋白PARP1、cleaved PARP1蛋白水平变化的情况。研究结果1、TBPoS-2OH作为光敏剂对黑色素瘤细胞的抗肿瘤作用评价:黑色素瘤A375和B16细胞经TBPoS-2OH处理并光照后,MTT结果显示TBPoS-2OH显著抑制了细胞的活力;而未经光照时,TBPoS-2OH对A375和B16细胞的活力无显著的抑制作用。Calcein-AM/PI双染法实验结果也显示:TBPoS-2OH孵育并经光照后,B16和A375细胞发生了明显的死亡,且随着TBPoS-2OH浓度的增加,死亡的细胞比例也随之增加。荧光显微镜可观察到经TBPoS-2OH处理并光照后,A375和B16细胞出现凋亡特征性形态学变化,进一步的细胞结果发现:在TBPoS-2OH处理并光照后,A375和B16细胞的凋亡率明显升高。2、TBPoS-2OH在A375和B16细胞内的分布情况:A375和B16细胞经TBPoS-2OH孵育后,荧光显微镜检测结果显示:随着孵育时间的延长,细胞中的红色荧光强度不断增强;溶酶体和线粒体荧光探针的亚细胞定位实验结果提示TBPoS-2OH被细胞吸收后,主要富集在溶酶体。3、TBPoS-2OH在A375和B16细胞PDT治疗中的分子作用机制:A375和B16细胞经TBPoS-2OH处理并光照后,细胞内的ROS水平显著增加。Western blot检测结果显示:经TBPoS-2OH处理并光照后,A375和B16细胞中的线粒体介导的凋亡途径相关蛋白发生明显改变,其中,Bcl-2和Bid蛋白水平降低,Bax蛋白水平升高,胞浆中Cyto-c和Apaf-1的水平增加,并且在TBPoS-2OH处理过的细胞中,凋亡相关蛋白 cleaved caspase-3、cleaved caspase-9 和 cleaved PARP1 的水平也显著增加。结论TBPoS-2OH对黑色素瘤细胞具有显著的光毒性和较低的暗毒性。TBPoS-2OH被细胞摄取后,主要分布在溶酶体,经光照射激发后,导致细胞内生成大量活性氧（ROS）,引发溶酶体膜受损;线粒体膜上Bid被溶酶体释放的蛋白酶活化,刺激Bax表达增加,促进线粒体外膜的孔洞开放,线粒体内的Cyto-c被释放到胞浆,并和Apaf-1形成复合物,激活caspase-3/9和PARP1,最终诱导黑色瘤细胞的凋亡发生。以上研究结果表明,TBPoS-2OH对恶性黑色素瘤具有很好的体外PDT杀伤作用,并通过溶酶体介导的线粒体凋亡通路诱导黑素瘤细胞死亡。因此,新型卟啉烯衍生物TBPoS-2OH有望开发成为光动力治疗黑色素瘤的光敏剂。