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原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是发病率高、预后差的恶性肿瘤之一。术后高复发率是最终导致患者死亡的重要原因,严重影响HCC的预后。寻找复发的危险因素,从而采取有效措施预防和治疗复发是提高术后生存率的最重要策略之一。现有研究表明,肝癌术后复发相关的主要预后因素包括：肿瘤大小、结节数目、血管浸润、肿瘤有无包膜、术前AFP、转氨酶水平、术中有无输血及HBV感染等。目的：利用实时荧光定量PCR的方法检测肝组织及血清HBV共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA, cccDNA)水平,探讨HBV cccDNA水平及临床因素对肝细胞癌术后预后的影响。方法：收集60例自2003年12月-2006年8月住院的乙型肝炎相关HCC患者,记录患者术前Child-Pugh分级、是否肝硬化、AFP、肿瘤数目、大小、生长方式等指标,所有病例均留取新鲜的癌组织、癌旁组织和外周血标本,于-80℃冰箱保存。55例获得完整随访,肝组织DNA以限制性内切酶HindⅢ联合质粒安全的ATP依赖DNA酶(Plasmid-Safe-ATP-Dependent DNase, PSAD)进行消化,然后采用荧光定量PCR检测(?)HBV cccDNA和HBV DNA;分析其与临床、病理特征等指标对无瘤生存率、总体生存率的影响。累积生存率计算采用寿命表法；单因素分析采用Kaplan-Meier,(?)将单因素分析有统计学意义的变量引人Cox比例风险模型分析,P<0.05为差异有统计学意义。结果：60例患者中男性51人,女性9人,平均年龄53.37±11.49岁,5例无完整的随访资料。55例随访资料完整的患者,最长随访时间88个月,1、3、5年总体生存率为73%、51%和38%,中位总体生存期36.3个月,生存期超过6年9例,生存期超过7年2例；1、3、5年无瘤生存率为63%、29%和19%,中位无瘤生存期16.0个月。实时荧光定量PCR分析表明,血清HBV cccDNA仅有1例阳性(1/35),肝癌组织HBV cccDNA阳性率20.0%(11/55),根据13F(总HBV DNA引物)、13F+PSAD、13F+内切酶+PSAD、71F(HBV cccDNA选择性引物)、71F+PSAD、71F+内切酶+PSAD组间定量结果比较,选择性引物、PSAD和Hind Ⅲ内切酶三者联合应用,可降低约5个数量级的非特异扩增。癌组织、癌旁组织总HBV DNA、HBV cccDNA之间均存在正相关(r=0.437、0.478,P<0.05)；外周血总HBV DNA与癌组织HBV cccDNA呈低度正相关性(r=0.359,P<0.001),与癌旁组织HBV cccDNA无相关性(r=0.264, P=0.052)。 HBsAg(-)占20%(11/55),11例HBsAg(-)病例癌及癌旁组织中HBV DNA检出率100%。HBsAg(+)组肝癌及癌组织HBV DNA水平较较HBsAg(-)组差异有统计学意义(P=0.002、0.045),而HBsAg(+)组肝癌及癌组织HBV cccDNA水平较HBsAg(-)组差异无统计学意义(P=0.068、0.435)。单因素分析显示术前AFP水平(P=0.039)、生长方式(P<0.001)、肿块数目(P<0.005)、血管侵犯(P<0.001)、TNM分期(P=0.007)、肿块直径(P=0.028)是影响术后总体生存率的预后因素。Cox模型多因素分析显示肿块数目(P=0.011)、血管侵犯(P=0.001)是影响术后总体生存率的独立预后因素。单因素分析显示癌组织HBV cccDNA水平(P=0.028)、术前AFP水平(P=0.021)、生长方式(P=0.019)、肿块数目(P=0.006)、血管侵犯(P=0.048)、TNM分期(P=0.027)、病理分级(P=0.030)是术后无瘤生存率的预后因素。Cox模型多因素分析显示,癌组织HBV cccDNA水平(P=0.007)、生长方式(P=0.002)是影响术后无瘤生存率的独立预后因素。结论：本研究表明利用内切酶及PSAD消化肝组织DNA联合HBV cccDNA选择性引物,进行实时荧光定量PCR检测,可以更特异的测定癌及癌旁组织HBVcccDNA水平。通过5年以上的随访观察,发现癌组织HBV cccDNA水平<31og10copies/μg的患者术后无瘤生存率较高,肝组织HBV cccDNA可用于评估患者的预后。同时验证单发肿瘤、无血管侵犯的患者术后总体生存率较高；肝癌膨胀性生长的患者术后无瘤生存率较高。