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嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila,Ah)广泛存在于水环境中,对水生动物、爬行类、两栖类、鸟类及人类均可致病,是一种已引起广泛重视的人畜共患病病原菌。本实验室通过抑制性差减杂交方法得到18个与致病性相关的基因片段,通过与其它致病菌株的序列进行比对,选取3个胞外蛋白酶相关基因epr1、epr2、epr3和UDP-乙酰葡萄糖胺-4-差向异构酶基因gneJ。设计并合成4对引物,对本实验室保存的63株嗜水气单胞菌菌株进行PCR检测,了解嗜水气单胞菌不同分离株中这4个毒力基因片段的分布。根据检测结果,可分为5个毒力基因型：epr1+ epr2+ epr3+ gneJ+占47.6%(30/63)；epr1+ epr2+ epr3+ gneJ-占15.9%(10/63)；epr1- epr2+ epr3+ gneJ-占11.1%(7/63);epr1+ epr2- epr3+ gneJ-占9.5%(6/63);epr1- epr2- epr3+ gneJ-占15.8%(10/63),具备四种毒力基因的菌株比例最高。本试验从每个毒力基因型中选取一株代表菌株,进行了溶血性、溶蛋白活性、细胞毒性及小鼠半数致死量的研究。结果表明,epr1、epr2、gneJ均与嗜水气单胞菌致病性相关,epr3在所检测的菌株中都存在。不同毒力基因型的菌株在溶血性、溶蛋白性、细胞毒性及小鼠半数致死量方面存在明显差异。以强毒株J-1为代表株的epr1+epr2+ epr3+ gneJ+为主要毒力基因型,溶血价为1：256,溶蛋白效价为1：512,细胞毒性半数组织培养感染剂量(TCID50)为10-6.54,小鼠半数致死量为4.12×105。随毒力基因携带的减少,四种检测指标均有下降趋势。根据Ah J-1中epr1、epr2、epr3的测序结果,在ORF内设计编码成熟蛋白的引物进行PCR扩增,产物双酶切后定向克隆于表达载体pET-32a(+)中,同时通过双酶切将epr2,epr3在pET-32a(+)中进行串联。四个重组质粒转化表达宿主菌E. coli BL21,经IPTG诱导后epr1,epr2,epr3,epr2-3分别表达分子量为约36.4kDa、15.8kDa、38.2kDa和54kDa的蛋白。四个融合蛋白进行溶蛋白活性检测,epr1和epr2-3表达的蛋白均有明显的溶蛋白圈。免疫转印显示Ah J-1全菌抗血清可以识别这两个融合蛋白。纯化的两个表达蛋白分别免疫小鼠,三免后一周眼眶采血测抗体效价,待效价呈阳性,用50LD50(107CFU)的Ah J-1培养物,腹腔注射免疫后的小鼠,epr1、epr2-3的相对保护率分别为50%、60%。J-1培养上清经硫酸铵沉淀,离子交换层析和分子筛层析后,可以获得一种纯化的蛋白,分子量约为38kDa,该蛋白具有溶蛋白活性。对其进行二维电泳分析,观察到单一分子量的蛋白点,质谱分析。根据结果,设计引物,在J-1中进行编码该蛋白基因的PCR扩增并测序,结果与NCBI中基因序列比对,J-1中存在该段序列,编码弹性蛋白酶(elastase).其在细菌致病性中的作用和生物功能还待进一步研究。