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实验一Ghrelin对糖尿病心肌病大鼠心功能保护效应及机制研究第一部分Ghrelin对糖尿病心肌病大鼠心功能影响目的：探讨生长激素促分泌物受体的内源性配体ghrelin对糖尿病心肌病大鼠心功能的影响。方法：(1)通过高脂饮食+链脲佐菌素(Streptozoticin,STZ) (50mg/kg)诱导构建糖尿病心肌病大鼠模型； (2)用ghrelin (200ug/kg/d)腹腔注射连续干预糖尿病大鼠4周后,检测各组大鼠空腹血糖(Fasting blood glucose,FBG)及血清甘油三酯(Triglyceride, TG)、总胆固醇(Total cholesterol,TC)、低密度脂蛋白胆固醇(Low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(High density lipoprotein cholesterol,HDL-C)水平；(3)测定大鼠体重(Body weight,BW)和心脏质量(Heart weight,HW),计算大鼠心脏质量指数(Heart weight index, HWI);(4)超声心动图测定大鼠左室舒张末期内径(Left ventricular end-diastolic diameter, LVEDD)、左室收缩末期内径(Left ventricular end-systolic diameter, LVESD)、左室后壁厚度(Left ventricular posterior wall thickness,LWPWT)及室间隔厚度(Interventricular septal thickness at diastole,IVSD),同时通过同步心电图记录心率(Heart rate,HR),并以左心室射血分数(Left ventricular ejection fraction,LVEF)及缩短分数(Fractional shortening, FS)作为心功能评价指标； (5)采用HE染色(Hematoxylin-eosin staining)技术观察大鼠心肌组织结构。结果： (1)通过高脂饮食+链脲佐菌素成功构建糖尿病心肌病大鼠模型； (2)糖尿病大鼠FBG、血清TG、TC和LDL-C水平显著高于对照组大鼠(P<0.05),而给予ghrelin连续干预4周后,糖尿病+Ghrelin干预组大鼠FBG、TG和TC较糖尿病组显著降低(P<0.05)；(3)糖尿病大鼠体重较对照组显著降低,而心脏质量指数显著升高(P<0.05); Ghrelin干预后,糖尿病+ghrelin干预组大鼠体重增加,心脏质量指数下降(P<0.05)；(4)超声心动图显示,糖尿病组大鼠HR低于对照组,LVEDD、LVESD、LWPWT、IVSD较对照组显著升高,而LVEF和FS显著低于对照组(P<0.05); Ghrelin干预后,大鼠LVEDD、LVESD、IVSD降低,LVEF和FS显著升高(P<0.05)；(5)HE染色显示,对照组大鼠心肌细胞无肿大,排列紧密,细胞核呈椭圆型或圆形,位于细胞中央；糖尿病组大鼠心肌细胞肿大明显,排列紊乱,胞核居于细胞边缘,大小不一；Ghrelin干预后,大鼠心肌细胞可见无明显肿大,排列相对整齐,胞核清晰。结论：高脂饮食联合链脲佐菌素能成功构建糖尿病心肌病大鼠模型；糖尿病心肌病大鼠存在着严重的糖、脂代谢紊乱和心功能障碍,ghrelin能通过改善大鼠糖、脂代谢紊乱,提高糖尿病心肌病大鼠心室收缩功能,改善心肌结构。第二部分Ghrelin改善糖尿病心肌病大鼠心功能分子机制的研究目的：探讨ghrelin改善糖尿病心肌病大鼠心功能的分子机制。方法：(1)通过高脂饮食+链脲佐菌素(Streptozoticin, STZ) (50mg/kg)诱导构建糖尿病心肌病大鼠模型； (2)腹腔注射ghrelin (200ug/kg/d)连续干预糖尿病心肌病大鼠4周,收集各组大鼠心肌组织,采用实时荧光定量PCR测定大鼠心肌炎症调节因子：白介素(Interleukin,IL)-1β、IL-6、肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor, TNF)-α的mRNA表达； (3)实时荧光定量PCR测定大鼠心肌组织脂联素(Adiponectin)、基质金属蛋白酶(Matrix metallopeptidase, MMP)-2、MMP-8、MMP-9的mRNA表达； (4)采用Western-Blot检测各组大鼠心肌组织中AMPK、AKT、GSK-30蛋白及其磷酸化蛋白的表达。结果：(1)糖尿病心肌病组大鼠心肌组织中IL-1β、IL-6及TNF-a的mRNA表达水平较对照组显著升高(P<0.05),给予ghrelin干预后,大鼠心肌组织中IL-1β、IL-6及TNF-α的mRNA表达水平显著降低(P<0.05)：(2)糖尿病心肌病组大鼠心肌组织中脂联素、MMP-2的mRNA表达水平较对照组显著降低,而MMP-8升高(P<0.05),ghrelin干预后,大鼠心肌组织中脂联素和MMP-2的mRNA表达水平显著升高(P<0.05)； (3)糖尿病心肌病大鼠心肌组织中磷酸化的AMPK、AKT、GSK-3β蛋白表达水平较对照组显著降低,ghrelin干预后心肌组织中p-AMPK、p-AKT、p-GSK-3β蛋白表达水平显著增加(P<0.05)。结论：腹腔注射ghrelin显著改善糖尿病心肌病大鼠心功能,其机制可能是通过调控心肌组织纤维调节因子及炎症因子的mRNA表达,改善心肌纤维化,抑制心肌炎症反应,上述效应可能与其激活AMPK、 AKT/GSK-3β磷酸化蛋白表达有关。实验二大黄素对糖尿病心肌病大鼠心功能保护效应及机制的研究目的：探讨大黄素对糖尿病心肌病大鼠心功能的保护作用机制。方法：(1)通过高脂饮食+链脲佐菌素(Streptozoticin,STZ) (50mg/kg)诱导构建糖尿病心肌病大鼠模型； (2)用不同剂量的大黄素(50mg/kg/d、100mg/kg/d)灌胃干预糖尿病大鼠16周后,称量各组大鼠体重及心脏质量,计算心脏质量指数；(3)检测各组大鼠空腹血糖(Fasting blood-glucose,FBG),血清甘油三酯(Triglyceride,TG)、总胆固醇(Total cholesterol,TC)、低密度脂蛋白胆固醇(Low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(High density lipoprotein cholesterol,HDL-C)水平； (4)通过超声心动图测定大鼠心脏结构,测量大鼠左室舒张末期内径(Left ventricular end-diastolic diameter,LVEDD)、左室收缩末期内径(Left ventricular end-systolic diameter,LVESD)、左室后壁厚度(Left ventricular posterior wall thickness,LWPWT)及室间隔厚度(Interventricular septal thickness at diastole,IVSD),通过同步心电图记录心率(Heart rate,HR),并采用左心室射血分数(Left ventricular ejection fraction,LVEF)及左心室缩短分数(Fractional shortening, FS)作为心功能评价指标；(5)采用Western-Blot检测大鼠心肌组织中AKT、GSK-3p蛋白及其磷酸化蛋白的表达。结果： (1)糖尿病心肌病大鼠体重,心脏质量均较对照组显著降低,而心脏质量指数显著高于对照组,大黄素50mg/kg、100mg/kg治疗组大鼠体重较糖尿病心肌病组大鼠显著升高,心脏质量指数显著降低(P<0.05)； (2)糖尿病组大鼠FBG、血清TG、TC和LDL-C水平明显高于对照组,大黄素50mg/kg、100mg/kg治疗组大鼠FBG、血清TG和TC水平较糖尿病心肌病组显著降低(P<0.05)； (3)超声心动图显示,糖尿病心肌病组大鼠LVEDD、LVESD、LWPWT和IVSD较对照组大鼠显著升高,而HR、LVEF及FS较对照组显著降低(P<0.05),大黄素干预治疗后,大黄素50mg/kg治疗组大鼠HR升高,LVESD及IVSD较糖尿病心肌病组降低(P<0.05),大黄素100mg/kg治疗组大鼠HR、LVEF及FS较糖尿病心肌病组大鼠显著升高,同时,LVEDD、LVESD、LWPWT和IVSD较糖尿病心肌病组大鼠显著降低(P<0.05)； (4)与对照组相比,糖尿病心肌病组大鼠心肌组织中p-AKT、p-GSK-3β蛋白表达显著降低,而大黄素50mg/kg、 100mg/kg治疗组p-AKT、p-GSK-3β蛋白表达较糖尿病心肌病组显著升高(P<0.05)。结论：大黄素能改善糖尿病心肌病大鼠糖、脂代谢紊乱,提高左心室收缩功能,改善心功能障碍,其机制可能与AKT/GSK-3β介导的信号通路激活相关。