基于纳米磁珠的牛乳中κ-酪蛋白快速检测方法的建立

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蛋白质是牛乳中最有价值的营养成分,其中酪蛋白占牛乳中总蛋白量的80%,含量相对稳定,因此可以将酪蛋白的含量作为判断牛乳蛋白掺假的指标。牛乳中酪蛋白的种类主要包括αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白四种,其中κ-酪蛋白作为抗原有着很高的特异性,通过检测牛乳中κ-酪蛋白的含量来计算牛乳样品中的蛋白总量,来判断牛乳样品中是否有蛋白掺假现象。本研究以购买的κ-酪蛋白标准品为免疫原,通过快速足垫法和常规腹腔注射法分别对两组同批次6-8周龄雌性BALB/C小鼠进行免疫,将已免疫小鼠的腘淋巴结细胞(或脾细胞)与骨髓瘤细胞(sp2/0)在PEG诱导下进行融合,通过克隆化培养获得了能稳定分泌抗κ-酪蛋白抗体的杂交瘤细胞株,并利用Protein G亲和层析柱进行了腹水纯化。实验共获得了三株杂交瘤细胞株(1C4、3G3、3E6),所分泌的抗体亚类均为lgG1,其中3G3与3E6抗原识别表位不同,1C4与3E6抗原识别表位相近,1C4株腹水纯化后效价为1.28×106其亲和力常数为2.89×108mol/L。制备出了亲和力较好的抗κ-酪蛋白单克隆抗体,并用纯化后的腹水建立了基于纳米磁珠的夹心ELISA检测方法和单抗-抗原-酶标多抗模式的夹心ELISA检测方法,为牛奶酪蛋白的快速检测奠定了基础。基于纳米磁珠的夹心ELISA检测方法的标准曲线的线性回归方程为y=2.814x+1.24,相关系数R2=0.984,线性检测范围为1-32μg mL-1,最低检测限理论值为为0.42ng mL-1。建立的单抗-抗原-酶标多抗模式的夹心ELISA的线性回归方程为y=8.684x–14.11,相关系数R2=0.991,线性检测范围为0.25-8μg mL-1,最低检测限理论值为0.043μg mL-1。两种检测方法相比较,纳米磁珠与单克隆抗体偶联物可以使检测反应更为快速充分,缩短了检测时间,提高了效率。分别用建立的两种检测方法对随机抽取的牛乳样品进行了实际检测,结果均与凯氏定氮法的检测结果相符,说明该方法可以用于实际样品检测且基于纳米磁珠的夹心ELISA检测方法可以更好地用于实际应用。
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