动物肉是人类摄取蛋白的主要来源,但由于动物养殖过程中,头孢抱类和多粘菌素类等抗生素的大量和长期使用,因动物肉源细菌耐药水平的升高导致的人类健康风险不断提升。沙门氏菌是人类主要的食源性致病菌,由于其耐药性的产生,造成了人类治疗沙门氏菌感染疾病的困难。因此了解动物肉源沙门氏菌污染情况和耐药性传播机制,对有效控制耐药沙门氏菌的传播和治疗食源性沙门氏菌疾病具有重要意义。本文主要围绕深圳地区猪肉、牛肉、鸡肉、虾肉动物肉源样品中沙门氏菌的分离方法,CTX-M型ESBLs和mcr-1耐药基因的污染情况和传播机制展开研究,旨在为更好的分离检测动物肉源食品中沙门氏菌,以及动物养殖中抗生素的合理使用和临床预防、治疗食源性沙门氏菌疾病提供一定的理论依据。1.不同分离方法获得的动物肉源沙门氏菌的特征本研究旨在了解目前深圳市动物肉源沙门氏菌的流行和分布情况以及不同分离方法对动物肉源沙门氏菌分离情况的影响,为动物肉源中沙门氏菌的分离和鉴定,以及深圳地区合理控制动物肉源中沙门氏菌的传播提供一定的理论依据。首先,我们对采集自深圳地区的1055个动物肉源样品进行沙门菌的分离鉴定。结果显示,样品总的阳性率为21.71%(229/1055),其中鸡肉的阳性率为29.19%(61/209)、猪肉26.01%(148/569)、牛肉 15.00%(15/100)、虾肉 2.82%(5/177);其中,85%(195/229)的沙门阳性样品通过TT增菌液获得,30%(69/229)是通过RV增菌液获得。其次,通过MIC方法去掉重复的沙门氏菌,共得到376株非重复沙门菌株。其中290(77.13%)株非重复沙门菌株来自于TT增菌液,只有86(22.87%)株来自于RV作为增菌液处理过的样品;60%的菌株来源于XLT4平板,31%来源于含有环丙沙星药板和7%的头孢噻肟药板,仅有1.6%来源于BGA平板。第三,通过血清鉴定技术,对获得的376株沙门氏菌进行血清型鉴定与分析。共得到38种血清型及329株确定血清型的非重复沙门氏菌,最为流行的血清型包括Derby、1,4,[5],12:i:-、Rissen、Agona和8,20:z23,z4:-。38种血清型中,35种可以通过TT肉汤选择性增菌后分离得到,几乎是RV肉汤的两倍(35/19),特别是最主要的几种血清型,包括Derby、Agona和Risseen。综上所述,深圳地区动物肉源沙门氏菌污染比较严重,血清型以Derby、1,4,[5],12:i:-、Rissen、Agona和8,20:z23,z4:-为主;并且TT相比于RV肉汤,以及XLT4平板相比于BGA平板,在分离沙门氏菌的过程中更加有效,TT和XLT4平板的结合使用可以在沙门氏菌的分离中有更好的表现。2.沙门氏菌CTX-M型ESBLs耐药基因的检测及其行流性传播机制研究为了解动物肉源沙门氏菌CTX-M型ESBLs的流行和传播,本研究首先对定点采集两年的深圳市不同地区超市和市场的新鲜动物肉样品进行沙门氏菌的分离和耐药性监测,结果共检出沙门氏菌阳性肉样217个,分离非重复沙门氏菌336株,分离率为20.91%,其中沙门氏菌在鸡肉中分离率最高,为26.4%。药敏试验表明,深圳地区动物肉源沙门氏菌多重耐药现象严重,但是对氨基糖苷类的阿米卡星和碳青霉烯类的美罗培南仍然较为敏感,对头孢类抗生素有一定的耐药性。其次,对336株沙门氏菌进行blaCTX-M基因检测和PFGE分型分析,结果共检出16株blaCTX-M 阳性菌株,只含有CTX-M-14和CTX-M-15两种基因,两种基因中以Indiana和O4,O12:i:-血-清型为优势血清型;PFGE分析显示CTX-M-14和CTX-M-15两种基因在深圳地区动物肉源沙门氏菌中的传播主要以水平传播为主,在同种肉源中存在克隆传播现象。最后,对blaCTx-M阳性菌株进行接合转移实验和对原菌以及接合子进行S1-PFGE分析,结果表明,接合成功的7株沙门氏菌全部来自于猪肉,O4,O12:i:-血清型在可转移接合沙门氏菌中为优势血清型;S1-PFGE结果显示可转移质粒大小在～30kb-～250kb之间,说明blaCTX-M在不同大小质粒中分布范围较广;PFGE分型表明,7株沙门氏菌同源性较低,说明深圳地区动物肉源沙门氏菌blaCTX-M基因的传播主要以水平传播为主。综上所述,深圳地区动物肉源沙门氏菌检出率较高,分离菌株的多重耐药现象较严重;blaCTX-M基因在动物肉源沙门氏菌中主要以CTX-M-14和CTX-M-15两种形式存在,Indiana和O4,O12:i:-为两种基因的优势血清型;沙门氏菌中含有CTX-M-14和CTX-M-15基因的质粒均存在接合转移现象,以水平传播为主,同种肉源样品内部也存在克隆传播现象。3.动物肉源沙门氏菌mcr-1耐药基因的检测及其流行病学研究为了解目前深圳市乃至全国动物肉源沙门氏菌多粘菌素耐药基因mcr-1的携带情况,及mcr-1随质粒接合转移的能力,以指导动物养殖中多粘菌素的合理使用,及给临床预防多粘菌素耐药性的传播提供一定的理论依据。首先,我们对来自深圳市的830株非重复沙门氏菌和全国其他20余省市的230株非重复的沙门氏菌,进行mcr-1耐药基因的筛选和mcr-1 阳性沙门氏菌的血清型鉴定,结果共得到mcr-1阳性菌株16株,全部来自猪肉样品,分离率分别为1.4%(12/830)和1.7%(4/230);血清型以Derby(n=9)和 Typhimurium(n=6)为主,也有 Weltevreden(n=1)血清型的存在;Typhimurium血清型耐药谱一般比Derby和Weltevreden两种血清型宽,表现出更加明显的多重耐药性。第二,对这些菌株采用CLSI推荐的琼脂稀释法进行13种药物的药敏试验,结果表明16株菌均对多粘菌素有较高的耐药(8μg/mL-16μg/mL),并且对四环素、氨苄西林全部耐药,对氯霉素耐药率(75%)也较高,仅有4株表现出敏感性,对阿莫西林/克拉维酸(12.5%)和环丙沙星(18.75%)等其他抗生素敏感性较好,另外对阿齐霉素全部敏感;大部分多粘菌素耐药沙门氏菌为多重耐药,一般为四重以上,最多为八重耐药。第三,采用PFGE分型方法对mcr-1阳性沙门氏菌进行分型,结果显示,所有菌株可以分为6个基因型,基因型呈现多样化;来自深圳地区的9株Derby和2株Typhimurium相似度为100%,来自全国其他省市的3株Typhimurium和1株Weltevreden同源性较低,且仅有1株与深圳地区的2株Typhimurium同源性为100%。最后,对所有mcr-1阳性沙门氏菌采用接合转移方法,用J53作为受体菌进行接合转移,结果表明16株菌全部接合成功,接合成功率为100%;原菌和接合子的药敏试验结果表明,所有接合子均获得了对多粘菌素4μg/mL-8μg/mL的耐药值,对其他抗生素的耐药性也有不同程度的提升,并且也有部分接合子对头孢噻肟和头孢曲松产生了较高的耐药值。综上所述,深圳市乃至全国动物肉源mcr-1阳性沙门氏菌检出率相对较低,但是绝大多数表现出四重以上的耐药性,接合转移成功率较高,血清型以Typhimurium和Derby为主;全国范围内动物肉源沙门氏菌mcr-1耐药基因的传播以水平传播为主,但深圳地区动物肉源沙门氏菌mcr-1耐药基因的传播以克隆传播较多,可能与样品采集范围有关。4.动物肉源沙门氏菌mcr-1耐药基因传播机制的研究为探讨动物肉源沙门氏菌mcr-1耐药基因的传播机制,首先,利用S1-PFGE和Southern Blot技术对接合成功的沙门氏菌及其接合子进行质粒分析。结果表明,mcr-1基因主要存在～30kb和～244kb大小的两种质粒中,分别在14株和2株沙门氏菌中检出,没有在一株菌中发现同时含有两种mcr-1质粒的情况。其次,对具有代表性的SA258、SA618、SA655三株接合子中的质粒进行提取,并利用质粒测序技术对提取到的三个质粒进行测序,然后利用质粒分析软件对所得序列进行分析,再与其他参考序列进行比对。结果显示,所测质粒中,～30kb质粒为IncX4类型,～244kb质粒为IncHI2类型。分别将这两种类型质粒与GenBank中的参考序列比对分析,结果显示两种质粒与参考序列都具有很高的相似度,都含有与转移相关基因tra等;其中～33kb质粒与参考质粒pOW3E1相似度在99%以上,～244kb质粒与pHNSHP45-2参考质粒相比除了缺少一个主干区域外,还含有耐药基因blaCTX-M-14和fosA3等,这也解释了含有此质粒沙门氏菌对头孢和磷霉素耐药的现象。综上所述,mcr-1基因在动物肉源沙门氏菌中的传播主要以水平传播为主,范围较广;全国不同地区动物肉源沙门氏菌mcr-1基因集中分布在IncX4和IncHI2两种类型质粒中,携带mcr-1基因的质粒与已报道的同类型质粒序列高度相似,但是携带了更多的耐药基因。