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玉米是一种重要的粮食作物,在饲料加工等方面具有重要的应用价值。玉米花粉的育性是否正常是保证受精作用和产量形成的重要前提。课题组前期发现玉米花粉类受体胞质蛋白激酶ZmSTK1在成熟的花粉中表达。该基因突变后玉米花粉的萌发率显著降低。ZmSTK1蛋白中包含普通胁迫蛋白USP结构域和激酶域。其中,激酶域可以与烯醇化酶1互作,调节糖酵解途径中烯醇式丙酮酸的合成。USP结构域与植物逆境胁迫响应有关,因此推测ZmSTK1可能与花粉发育过程中逆境胁迫响应有关。本实验利用免疫共沉淀和酵母双杂交技术筛选和验证ZmSTK1中USP结构域的互作蛋白,为探索花粉发育过程中的细胞信号转导途径及其分子调节机理提供理论依据。实验方法及结果如下:1.根据课题组前期构建成功的p ET30a-ZmSTK1-USP原核表达载体诱导表达ZmSTK1-USP重组蛋白,并对重组蛋白进行亲和纯化。实验结果表明,表达出的目的蛋白分子量与理论分子量大小一致且纯化效果较好,可以用于抗体制备。利用Co-IP方法从花粉总蛋白中筛选互作蛋白。免疫共沉淀后的洗脱蛋白经SDS-PAGE检测,选取两条较明显的条带进行质谱分析,得到10个可能与ZmSTKl-USP相互作用的候选蛋白,分别为:5-甲基四氢蝶酰三谷氨酸高半胱氨酸甲基转移酶、2个肌动蛋白1、细胞分裂周期蛋白48、延伸因子1-α、翻译型延伸因子Tu、热激蛋白90 k Da、热激蛋白70 k Da、14-3-3蛋白和组蛋白H4。2.对ZmSTK1可能发生互作的蛋白进行预测。结果表明,在10个候选蛋白中有5个属于真核核糖体蛋白,推测ZmSTK1蛋白可能与核糖体相关蛋白发生互作,共同参与核糖体翻译与加工。依据Co-IP的质谱筛选结果,对ZmSTK1-USP和6个候选基因进行PCR扩增,获得ZmSTK1-USP、Actin1、EF1A、HSP90、MTR5、H4和EF-Tu基因的目的片段,并成功构建了7个酵母重组表达载体;通过酵母双杂系统验证与ZmSTK1-USP相互作用的蛋白质。将构建成功的酵母重组表达载体p GBKT7-ZmSTK1-USP+p GADT7和空载体p GBKT7分别转化酵母菌AH109。结果显示,外源蛋白ZmSTK1-USP对酵母菌自身生长无毒害作用,排除实验中的假阴性;诱饵重组表达融合蛋白无自激活作用,不能单独激活下游报告基因,排除实验中的假阳性。将诱饵质粒分别与捕获质粒共转化酵母AH109中。结果显示,ZmSTK1-USP与EF-Tu相互作用,而与其它候选蛋白不存在互作关系。该结果为更深入地探究ZmSTK1的作用机理奠定了一定的基础。