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神经突触的活动和调节影响着我们的决策、学习和记忆过程,而这些调节过程依赖于存在于突触末梢的突触囊泡。神经递质储存在突触囊泡内,它们伴随着突触囊泡与末梢前膜的融合而释放到突触间隙。但若干重要基本科学问题尚未完全了解。例如神经递质在突触囊泡中的储存是如何进行并被精细调节的?以及它们又是如何以特定的时空调节方式被精确释放的?上世纪九十年代末期,研究者们开发了一些能够反映囊泡融合的荧光探针,促进了神经递质的传递过程研究。Fluorescent false neurotransmitters(FFNs)是一类神经递质多巴胺的可视化追踪剂,作为囊泡单胺转运体的作用底物,能够被摄取到突触囊泡中,模拟多巴胺的摄取、释放过程,使用FFNs可以达到观测单个突触末梢的递质释放的检测水平。它能够在刺激诱导的胞吐过程中从突触末梢释放。儿茶酚胺转运蛋白SLC10A4属于钠/胆酸共转运家族(The solute carrier protein superfamily)其中的一员,研究报道它在大脑单胺能神经元和胆碱能神经元突触前囊泡特异表达并具有调节多巴胺的作用。它与囊泡乙酰胆碱转运体(VACh T)和囊泡单胺转运体(VMAT2)共定位。为了进一步探究SLC10A4是如何通过影响突触前囊泡功能,从而发挥对多巴胺调节作用的,本课题利用FFNs荧光示踪剂,探索了SLC10A4对多巴胺摄取、释放过程的影响。通过观察FFNs对Slc10a4基因敲除小鼠活体脑片的荧光标记量和释放过程,我们发现Slc10a4的敲除导致了囊泡DA储存量下降,影响了VMAT2对DA的摄取功能。这些结果提示SLC10A4在调节神经递质多巴胺的传递中扮演了重要角色并为我们治疗帕金森等神经退行性疾病提供了一些新的启示。目的:利用FFNs模拟突触末梢多巴胺的摄取、释放过程,探究SLC10A4对脑内多巴胺摄取、释放的影响。方法:1)用高效液相色谱法检测Slc10a4全敲小鼠、Slc10a4flox/flox;DAT-Cre+小鼠、Slc10a4flox/flox;TH-Cre+小鼠及同窝对照组小鼠各个脑区的多巴胺含量;2)皮下注射reserpine 24 h或腹腔注射TBZ 1 h后,用高效液相色谱法检测脑组织DA含量;3)使用振动切片法获得Slc10a4flox/flox;DAT-Cre+小鼠及同窝对照组小鼠纹状体区活体脑片,通氧复苏1h,FFNs孵育30 min,70 m M髙钾ACSF刺激使其释放,利用双光子显微镜采集荧光信号图像;4)用含10μM TBZ的ACSF预处理Slc10a4flox/flox;DAT-Cre+小鼠及同窝对照组小鼠纹状体区活体脑片20 min,抑制FFN511的摄取和释放;5)运用Slc10a4全敲小鼠、及同窝对照小鼠制备MPTP/p慢性模型,免疫组织化学法对多巴胺神经元进行染色、计数,观察多巴胺神经元存活状况;6)立体定位注射AAV-Slc10a4到Slc10a4全敲小鼠和WT小鼠的黑质致密部,免疫印迹法和免疫荧光染色法检测SLC10A4的过表达水平,高效液相色谱法检测纹状体组织的DA含量;7)皮下注射阿扑吗啡诱导在单侧黑质过表达AAV-Slc10a4的WT小鼠和KO小鼠旋转,并进行行为学检测。结果:1)Slc10a4敲除导致小鼠脑内多巴胺含量下降。Slc10a4全敲小鼠、Slc10a4flox/flox;DAT-Cre+条件性敲除小鼠、Slc10a4flox/flox;TH-Cre+条件性敲除小鼠纹状体、伏隔核多巴胺含量降低,黑质区多巴胺含量无明显变化;2)Slc10a4敲除导致在体注射VMAT2抑制剂reserpine和TBZ对VMAT2摄取的抑制作用减弱。在体注射reserpine导致WT小鼠纹状体多巴胺含量显著下降,对c KO小鼠无影响;注射TBZ后,c KO小鼠DA下降的程度不及WT小鼠明显;3)Slc10a4敲除导致胞内多巴胺含量下降;囊泡内多巴胺储存量减少;储存多巴胺的囊泡个数减少。FFN102标记的小鼠脑片,c KO小鼠的荧光强度明显弱于WT小鼠,髙钾刺激后c KO小鼠释放量有减弱趋势,脱色荧光点个数减少;FFN511标记下,c KO荧光强度略弱于WT小鼠,髙钾刺激后c KO小鼠释放量明显减少,脱色荧光点个数减少;4)荧光标记显示Slc10a4敲除导致TBZ对小鼠纹状体区脑片VMAT2摄取功能的抑制作用减弱。WT小鼠纹状体区脑片在TBZ处理后FFN511荧光标记强度减弱,释放量明显减少;Slc10a4条敲小鼠纹状体区脑片在TBZ处理后FFN511荧光标记强度无明显变化,释放量有所下降,但减少量不及WT小鼠明显;5)Slc10a4敲除导致多巴胺神经元对MPTP的敏感性增强。在慢性MPTP/p模型中,Slc10a4全敲小鼠黑质区DA神经元死亡数明显多于WT小鼠;6)过表达SLC10A4能够逆转Slc10a4全敲小鼠多巴胺含量的下降水平。注射AAV-Slc10a4使Slc10a4全敲小鼠纹状体脑区的多巴胺含量显著上升;WT小鼠多巴胺含量有上升趋势;7)过表达SLC10A4可能不增加多巴胺神经元突触后受体的敏感性。在WT和KO小鼠单侧黑质多巴胺能神经元过表达SLC10A4,阿扑吗啡诱导KO小鼠产生明显同侧旋转行为,而WT小鼠无明显同侧旋转行为。结论:Slc10a4的敲除导致突触末梢标记的多巴胺类似物的囊泡储存量下降,VMAT2的摄取功能受到影响,但不直接影响DA的转运,表明Slc10a4参与对VMAT2功能的调节。综上所述,本文的创新之处在于:VMAT2发挥神经递质多巴胺摄取作用的机制尚不完全为人们所认识。本研究利用新兴的可视化示踪剂荧光标记的多巴胺类似物FFNs模拟突触末梢多巴胺的摄取和释放过程,结合双光子显微镜实时观察活体脑片,发现Slc10a4敲除导致囊泡中多巴胺的储存量下降,高钾刺激后的释放量下降。在慢性MPTP/p模型中发现Slc10a4敲除增加了黑质多巴胺能神经元对MPTP的敏感性,说明SLC10A4对VMAT2的摄取功能有辅助作用,即与荧光标记的多巴胺类似物标记的结果相互映证。因此,本研究为深入理解神经递质多巴胺在囊泡储存过程提供了新的有意义的资料。