背景与目的正畸牙齿移动的生物学基础是在正畸矫治力作用下进行牙周组织改建。正畸矫治力经牙周膜传递至牙槽骨后,进行牙槽骨改建,包括压力侧的牙槽骨吸收和张力侧的新骨形成。在张力侧,受到牵张力作用的牙周膜干细胞（periodontal ligament stem cells,PDLSCs）将机械力信号转化为生物信号,参与张力侧新骨形成。然而,通过正畸治疗获得美观面形及良好的咬合关系时,存在牙槽骨丧失及牙龈退缩等问题。研究牵张力作用下牙槽骨改建的分子生物学机制,对于降低机械力的副作用,增加正畸治疗稳定性等方面具有重要临床意义。牵张力可使细胞中活性氧（reactive oxygen species,ROS）产生水平增加。生理状态下,ROS维持在生理水平,参与细胞的增殖、分化等过程。病理水平的ROS可导致细胞内DNA、蛋白质、脂质等生物分子的氧化损伤,与衰老、Ⅱ型糖尿病、肿瘤及神经退行性疾病的病理机制有关。细胞受到牵张力后ROS产生增加,可能激活机械敏感性细胞因子及相关信号转导通路,参与细胞的生理功能及疾病的病理过程。ROS过量产生可刺激破骨细胞的形成和分化,促进骨吸收;而抑制成骨分化及骨形成,导致骨形成与骨吸收之间不平衡,从而影响骨骼的形成与改建。ROS的过量产生及抗氧化因子水平降低与骨质疏松的发生、发展有关。抗氧化剂的使用对于促进成骨分化,预防和治疗骨质疏松具有积极作用。因此,在成骨分化过程中维持ROS水平至关重要。核因子 E2 相关因子 2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2）是参与细胞内抗氧化反应的重要的核转录因子,可维持细胞中ROS水平。在生理状态下,Nrf2及Kelch 样环氧氯丙烷相关蛋白 1（kelch-like ECH-associated protein 1,Keap1）结合,位于细胞质中,Nrf2被泛素化降解。机体受到亲电子物质或者氧化剂的作用时,Keap1及Nrf2构象改变,二者相互作用被破坏,Nrf2易位至细胞核中并结合至抗氧化反应元件（antioxidant response elements,ARE）上,从而参与诱导Nrf2下游抗氧化因子的表达,如血红素氧合酶-1（heme oxygenase-1,HO-1）、过氧化氢酶（catalase,CAT）、醌氧化还原酶1（NADPH quinone oxidoreductase 1,NQO1）等,以发挥抗氧化作用,从而维持细胞稳态及正常功能。Nrf2是一种机械敏感性转录因子,剪切力、超声、牵张力等机械刺激可调节Nrf2表达,参与细胞的生理功能及疾病的病理过程。以往研究表明,抗氧化核转录因子Nrf2参与成骨分化。缺乏Nrf2的小鼠由于骨形成和骨吸收间不平衡,导致骨量和骨强度较低。在正畸牙移动的张力侧成骨分化过程中,是否影响PDLSCs中ROS的产生水平及抗氧化核转录因子Nrf2的表达,以及Nrf2参与牵张力作用下成骨分化的分子机制尚无相关研究。由于ROS与Nrf2在牵张力及成骨分化中发挥重要作用,本研究旨在阐述:1、在周期性牵张力促进PDLSCs成骨分化中,是否影响ROS的产生水平;2、抗氧化核转录因子Nrf2是否参与周期性牵张力促进PDLSCs成骨分化过程;3、Nrf2激活剂t-BHQ对大鼠正畸牙移动张力侧成骨分化的影响;4、通过液相色谱串联质谱分析（liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS）技术筛选相关的差异表达蛋白质,并对差异表达蛋白质进行生物信息学分析,从而了解Nrf2参与周期性牵张力促进PDLSCs成骨分化过程的相关分子生物机制。研究Nrf2在周期性牵张力促进PDLSCs成骨分化过程中的作用及机制,对于降低机械力的副作用,增加正畸治疗稳定性等方面具有重要临床意义。材料与方法1、PDLSCs的分离、培养与鉴定本研究应用组织块法培养人PDLSCs,使用流式细胞仪检测PDLSCs表面标志物STRO-1、CD146、CD34及CD45。对PDLSCs进行成骨、成脂、成软骨分化诱导实验以评价PDLSCs多向分化潜能。2、10%0.5 Hz周期性牵张力对PDLSCs成骨分化的影响使用Flexercell FX-5000细胞应力加载系统对PDLSCs加载牵张幅度10%、加力频率0.5 Hz的周期性牵张力。使用qRT-PCR及Western blot、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）染色和ALP活性分析实验以检测成骨分化相关因子1型胶原蛋白（collagen type 1,COL1）、runt 相关转录因子 2（runt-related transcription factor 2,RUNX2）、骨桥蛋白（osteopontin,OPN）、ALP 的表达情况。3、10%0.5 Hz周期性牵张力对PDLSCs中ROS产生水平的影响使用流式细胞仪对PDLSCs中ROS及超氧阴离子自由基（superoxide radical anion,O2·-）水平进行检测分析。使用过氧化氢（hydrogen peroxide,H2O2）检测试剂盒检测PDLSCs中H2O2水平。4、Nrf2在周期性牵张力诱导PDLSCs成骨分化中的作用（1）周期性牵张力对PDLSCs中Nrf2及其下游抗氧化因子表达的影响使用qRT-PCR及Western blot实验检测周期性牵张力作用下PDLSCs中Nrf2及其下游抗氧化因子HO-1及NQO1表达情况。利用亚细胞结构胞核与胞浆蛋白抽提试剂盒提取PDLSCs中胞浆及胞核蛋白质,以检测胞浆及胞核中Nrf2蛋白质表达水平。（2）ROS的产生在诱导Nrf2表达中的作用通过CCK-8实验筛选ROS清除剂N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine,NAC）浓度。流式细胞术检测NAC处理后周期性牵张力下PDLSCs中ROS产生水平。通过qRT-PCR及Western blot实验检测NAC处理后周期性牵张力下Nrf2、HO-1、NQO1表达水平。（3）敲减Nrf2表达对周期性牵张力诱导PDLSCs成骨分化的影响使用siNrf2转染PDLSCs,qRT-PCR及Western blot实验验证siNrf2转染效率。流式细胞术检测siNrf2转染PDLSCs后,周期性牵张力下PDLSCs中ROS产生水平。使用qRT-PCR、Western blot、ALP染色和ALP活性分析实验以检测siNrf2对成骨分化相关因子（COL1、RUNX2、OPN及ALP）表达水平的影响。（4）Nrf2激活剂t-BHQ对周期性牵张力诱导PDLSCs成骨分化的影响通过CCK-8实验筛选叔丁基对苯二酚（tert-butylhydroquinone,t-BHQ）浓度。使用qRT-PCR及Western blot实验检测Nrf2及其下游抗氧化因子HO-1及NQO1表达水平。流式细胞术检测t-BHQ处理后,周期性牵张力作用下PDLSCs中ROS产生水平。使用qRT-PCR、Western blot、ALP染色和ALP活性分析实验以检测t-BHQ作用下成骨分化相关因子的表达水平。5、Nrf2激活剂t-BHQ对大鼠正畸牙移动张力侧成骨分化的影响（1）大鼠正畸牙移动模型的建立以大鼠上颌中切牙作为支抗,使用镍钛拉簧对大鼠上颌第一磨牙施加25 g拉力以近中移动上颌第一磨牙。将大鼠分为对照组及t-BHQ治疗组。（2）Nrf2激活剂t-BHQ对正畸牙移动张力侧牙周膜中Nrf2、HO-1表达的影响通过免疫组织化学（immunohistochemistry,IHC）染色检测上颌第一磨牙近中颊根的远中牙颈部牙周膜区域Nrf2、HO-1表达情况。（3）Nrf2激活剂t-BHQ对大鼠正畸牙移动张力侧成骨分化的影响选择大鼠上颌第一磨牙近中颊根的远中牙颈部牙槽骨作为感兴趣区域（range of interest,ROI）,使用CT Analyser软件分析牙槽骨结构相关参数,如骨体积分数（bone volume/tissue volume,BV/TV）、骨小梁分离度（trabecular separation,Tb.Sp）、结构模型指数（structure model index,SMI）及骨小梁厚度（trabecular thickness,Tb.Th）。通过IHC染色检测上颌第一磨牙近中颊根的远中牙颈部牙周膜区域ALP、COL1表达情况。6、Nrf2参与周期性牵张力诱导PDLSCs成骨分化的潜在分子机制通过LC-MS/MS质谱分析技术,对对照组及siNrf2组间的蛋白质进行定量检测,筛选差异表达蛋白质,并进行生物信息学分析,通过qRT-PCR、Western blot、免疫共沉淀（co-immunoprecipitation,Co-IP）等实验方法验证LC-MS/MS质谱分析结果,以探讨Nrf2在周期性牵张力诱导PDLSCs成骨分化过程中的潜在分子机制。结果1、PDLSCs的分离、培养与鉴定组织块法培养获得PDLSCs。流式细胞术检测结果表明,PDLSCs高表达STRO-1及CD146,低表达CD34及CD45。对PDLSCs进行成骨、成脂、成软骨分化诱导后,分别进行茜素红、油红O及阿利辛蓝染色,结果表明PDLSCs具有向成骨、成脂、成软骨分化潜能,说明PDLSCs具有多向分化能力。2、10%0.5 Hz周期性牵张力促进PDLSCs成骨分化10%0.5 Hz周期性牵张力促进PDLSCs中成骨分化相关因子COL1、RUNX2、OPN的表达水平,并增强PDLSCs中ALP活性。上述结果表明,10%0.5 Hz周期性牵张力促进PDLSCs成骨分化。3、10%0.5 Hz周期性牵张力促进PDLSCs中产生ROS通过流式细胞仪检测分析及镜下观察,周期性牵张力作用1 h时,PDLSCs中ROS水平开始增加,12 h时ROS水平达峰值,随后ROS水平逐渐降低但仍高于对照组。在周期性牵张力作用1h时,细胞中O2-·水平开始增加,3 h时O2·-水平达峰值,随后O2·-水平与对照组相比无统计学差异。PDLSCs中H2O2含量在周期性牵张力作用12 h、24 h和36 h显著增加。以上结果表明,10%0.5 Hz周期性牵张力增加PDLSCs中ROS的产生,包括O2·-和H2O2。4、Nrf2在周期性牵张力促进PDLSCs成骨分化中的作用（1）10%0.5 Hz周期性牵张力促进PDLSCs中Nrf2及其下游抗氧化因子的表达10%0.5 Hz周期性牵张力促进PDLSCs中Nrf2 mRNA表达,且细胞核及细胞质中Nrf2蛋白表达水平上调。周期性牵张力增加PDLSCs中Nrf2下游抗氧化因子HO-1及NQO1表达水平。以上结果说明,抗氧化核转录因子Nrf2可能在周期性牵张力促进PDLSCs成骨分化过程中发挥作用。（2）PDLSCs中Nrf2的表达增加与周期性牵张力作用下ROS产生有关NAC处理可降低周期性牵张力作用下PDLSCs中ROS产生。NAC抑制周期性牵张力作用下Nrf2、HO-1、NQO1的表达水平,因此推测PDLSCs中Nrf2表达增加与周期性牵张力作用下细胞中ROS产生有关。（3）敲减Nrf2表达抑制周期性牵张力下PDLSCs成骨分化使用siNrf2敲减Nrf2表达后,周期性牵张力作用下PDLSCs中ROS产生增加,下调成骨分化相关因子COL1、RUNX2、OPN、ALP表达水平;加入ROS清除剂NAC后,抑制周期性牵张力作用下siNrf2转染PDLSCs中ROS产生,改善成骨分化相关因子的表达。以上结果表明,Nrf2在周期性牵张力促进PDLSCs成骨分化中发挥重要作用,可能与维持ROS产生水平有关。（4）Nrf2激活剂t-BHQ促进周期性牵张力下PDLSCs成骨分化Nrf2激活剂t-BHQ可促进Nrf2、HO-1、NQO1表达,抑制周期性牵张力作用下PDLSCs中ROS产生,促进成骨分化相关因子COL1、RUNX2、OPN的表达,并增强ALP活性。以上结果表明,Nrf2激活剂t-BHQ促进周期性牵张力作用下PDLSCs成骨分化,进一步证实Nrf2在周期性牵张力促进PDLSCs成骨分化中发挥重要作用。5、Nrf2激活剂t-BHQ促进大鼠正畸牙移动张力侧成骨分化（1）Nrf2激活剂t-BHQ促进大鼠正畸牙移动张力侧牙周膜中Nrf2、HO-1表达在正畸加力的第7、14及28天,在大鼠上颌第一磨牙近中颊根远中牙颈部牙周膜处,与对照组相比,t-BHQ组大鼠张力侧牙周膜中Nrf2及HO-1表达增加。（2）Nrf2激活剂t-BHQ促进大鼠正畸牙移动张力侧成骨分化在正畸加力第14天及28天,t-BHQ组大鼠张力侧牙槽骨结构改善较明显,主要表现为BV/TV、Tb.Th高于对照组;Tb.Sp及SMI低于对照组。在t-BHQ组大鼠张力侧牙周膜中成骨分化相关因子ALP及COL1表达上调。上述结果表明,t-BHQ增加Nrf2的表达有利于大鼠正畸牙移动模型中张力侧成骨分化。6、Nrf2通过PI3K/Akt信号通路参与周期性牵张力作用下PDLSCs成骨分化使用京都基因和基因组百科全书（kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG）数据库对差异表达蛋白质进行分析,并参考相关文献,选择磷酸肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K）/蛋白激酶 B（protein kinase B,Akt）通路进行研究。使用PI3K/Akt通路抑制剂LY294002处理PDLSCs,周期性牵张力作用下磷酸化Akt（phosphorylated Akt,p-Akt）表达受到抑制,LY294002下调周期性牵张力作用下Nrf2的表达,并降低成骨分化相关因子COL1、RUNX2、OPN的表达水平。Co-IP实验结果证实周期性牵张力作用下Akt与Nrf2存在蛋白质间相互作用。以上结果证实PI3K/Akt信号通路参与周期性牵张力促进PDLSCs成骨分化过程中Nrf2表达。7、Nrf2参与周期性牵张力下PDLSCs成骨分化与HO-1及SOD2蛋白质间相互作用有关利用基因/蛋白质相互作用检索工具（the search tool for the retrieval of interacting genes/proteins,STRING）对差异表达蛋白质进行蛋白质间相互作用分析,结果表明Nrf2下游抗氧化因子HO-1与超氧化物歧化酶2（superoxide dismutase 2,SOD2）之间可能存在蛋白质间相互作用。实验结果表明周期性牵张力促进PDLSCs中SOD2mRNA相对表达量及其蛋白表达水平。Co-IP结果证实在周期性牵张力促进PDLSCs成骨分化过程中,HO-1与SOD2存在蛋白质间相互作用。结论本研究通过体内及体外实验证实Nrf2在周期性牵张力促进成骨分化中的重要作用,并通过LC-MS/MS质谱分析技术对Nrf2参与成骨分化的潜在机制进行初步探讨。本研究主要得出以下结论:1、ROS-Nrf2参与周期性牵张力促进PDLSCs成骨分化过程;2、Nrf2激活剂t-BHQ促进大鼠正畸牙移动过程中张力侧成骨分化;3、Nrf2参与周期性牵张力促进PDLSCs成骨分化与PI3K/Akt通路及HO-1与SOD2蛋白质间相互作用有关。本研究表明,Nrf2在周期性牵张力促进PDLSCs成骨分化中发挥积极作用,Nrf2可能是正畸治疗中潜在作用靶点,对于改善正畸牙移动张力侧成骨分化,降低机械力的副作用,增加正畸治疗稳定性等方面具有重要临床意义。