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维生素C(Vitamin C，VC)，又称L-抗坏血酸(L-AscorbicAcid，L-AA)，是一种水溶性维生素，在保持和促进人体健康以及动物生长方面具有重要的作用。但由于本身化学结构极不稳定，限制了应用范围。研究发现，VC糖基衍生物2-O-α-D-吡喃葡萄糖基-L-抗坏血酸(AA-2G)具有安全、稳定性强和在体内易降解产生L-AA等优点，能更好地为人体和动物吸收和利用，因而更具优势。AA-2G是利用糖基转移酶特异性的转糖基作用将糖基供体上的葡萄糖苷转移到VC的C-2上合成的。来源于软化类芽胞杆菌Paenibacillus macerans的环糊精葡萄糖基转移酶(CGT酶(EC2.4.1.19))因其催化生产AA-2G底物来源广泛且产物特异性强而被认为是糖基转移酶的最优选择。研究发现以环糊精为糖基供体时，成本较高且转化效率较低，不利于AA-2G的工业化生产。因此，以价格低廉且易溶的麦芽糊精为糖基供体高度专一地合成AA-2G具有重要意义。本研究通过晶体结构模拟和文献参考确定了CGT酶底物结合的关键位点：-3亚位点和+1亚位点。以在大肠杆菌E. coli BL21(DE3)中成功表达的重组质粒pET20b(+)/cgt为模板，对CGT酶-3亚位点和+1亚位点附近的氨基酸残基进行定点饱和突变，构建了麦芽糊精底物特异性改善的突变体，提高了以麦芽糊精为糖基供体催化合成AA-2G的效率。其中，双亚位点复合突变体K47L/Y89F/N94P/D196Y/L194N/A230D/H233E以麦芽糊精为底物合成AA-2G的产量最高，达到2.37g·L-1，比野生型CGT酶提高了97.4%。通过酶学性质分析，确定了突变体酶促反应的最适温度与野生型一致为36oC。最适pH在5.5-7的范围内波动，可能与突变体引入的不同极性的氨基酸改变了底物结合活性位点可解离基团的pKa有关。另外发现突变体酶在40oC和pH5.5条件下仍能分别保持良好的热稳定性和酸耐受性。在最适温度和pH条件下，野生型(突变型)CGT酶均在反应24h时达到AA-2G产量的峰值。对获得的突变体进行动力学分析，发现高浓度的底物L-AA对突变型CGT酶催化的酶促反应具有抑制作用。模拟突变体的三维结构并进行分析，突变体底物特异性的改善可能与亚位点附近氨基酸残基的亲水性及与底物分子间的作用力的改变有关。