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第一部分妊娠期镉暴露对子代大鼠睾丸支持细胞的影响目的:妊娠期镉暴露对子代大鼠睾丸支持细胞的影响。方法:清洁级SD大鼠250±10g,雌雄1:1或1:2合笼饲养,次日清晨检查阴栓或进行阴道涂片检查,发现阴栓或涂片发现精子记为妊娠期第0天,将孕鼠（F0代）随机分成4组,氯化镉（0、0.5、1、2mg/kg/day）灌胃染毒,染毒时间为妊娠第一天直至分娩（即1-21天）。F0代孕鼠自然分娩产下F1代雄鼠,常规喂养至5、21和56天（PND5、PND21、PND56）后,随机抽取每组F1代成年雄鼠与外来健康的雌鼠1:2合笼交配产生F2代,F2代雄鼠常规喂养后以同样的方式产生F3代成年雄鼠。收集F1、F2及F3代血清和睾丸,行组织病理学检查,经H&E染色后进行曲细精管（Seminiferous Tubule,ST）直径测量及Johnsen评分评价睾丸生长发育情况;透射电镜观察细胞超微结构;ELISA方法测定血清中促性腺激素释放激素（Gonadotropin-releasing hormone,Gn RH）、卵泡刺激素（Follicle Stimulating Hormone,FSH）激素水平;免疫组织化学方法进行睾丸组织细胞FSHR定位及表达量检测。结果:1、妊娠期镉暴露对子代大鼠生长发育和睾丸组织病理学的影响1.1基础数据显示:与对照组相比,F1代大鼠体重仅在PND5时,2mg/kg剂量组体重增加（P<0.05）;F2代大鼠体重仅在PND21时,1mg/kg剂量组体重增加（P<0.05）。1.2 H&E染色显示:F1代大鼠睾丸仅在PND5时,1mg/kg剂量组睾丸曲细精管直径减少（P<0.05）;F2代大鼠睾丸仅在PND56时,0.5mg/kg剂量组睾丸曲细精管直径减少（P<0.05）,在2mg/kg睾丸曲细精管直径增加（P<0.05）;F3代大鼠睾丸0.5mg/kg曲细精管直径增加（P<0.05）,其他各个剂量组Johnsen评分增加（P<0.05）;光学显微镜下显示三代各时期睾丸支持细胞未见异常变化,曲细精管内均可见完好精子发生。2、妊娠期镉暴露对子代睾丸支持细胞超微结构的影响透射电镜显示在F1代大鼠PND5、PND56睾丸支持细胞在对照组细胞膜完整、核膜完整与周围细胞联系紧密,剂量组观察到睾丸支持细胞超微结构发现改变,出现明显空泡化、水肿、坏死,并与周围细胞间隙增大。3、妊娠期镉暴露对雄性子代血清激素的影响血清激素水平检测显示:F1代结果:Gn RH在PND21,0.5mg/kg水平发生上升（P<0.05）。FSH在PND5时0.5mg/kg水平上升（P<0.05）;在PND21时各个剂量组血清中FSH水平下降（P<0.05）。F2代结果:FSH在PND5,0.5mg/kg水平上升（P<0.05）。F3代结果:Gn RH、FSH在F3代未见明显变化。4、妊娠期镉暴露对子代睾丸支持细胞分泌FSHR蛋白的影响妊娠期镉暴露后F1代PND56睾丸组织经免疫组织化学染色后观察到支持细胞分布在曲细精管基底面,未见游离支持细胞,正常组FSHR分布于基底面,蛋白AOD值为0.5090,剂量组FSHR蛋白同样分布于曲细精管基底面,蛋白AOD值为0.4011,与对照组相比,FSHR蛋白AOD值降低（P<0.05）。第二部分妊娠期镉暴露影响子代睾丸支持细胞机制探讨目的:妊娠期镉暴露对子代大鼠睾丸支持细胞的跨代效应机制研究。方法:收集第一部分的睾丸,采用q RT-PCR和Western blot检测FSHR/PI3K/AKT/FOXO1通路相关因子的m RNA、蛋白表达量和相关DNA甲基转移酶（DNMT1、DNMT3A、DNMT3B）m RNA、蛋白表达量;Agena Mass ARRAY（?）Methylation方法检测fshr、akt、foxo1相关基因启动子区甲基化水平。结果:1、妊娠期镉暴露对子代大鼠睾丸FSHR/PI3K/AKT/FOXO1通路相关因子的影响1.1 F1代结果:与对照组相比,雄性大鼠在PND5时,0.5mg/kg剂量组fshr m RNA表达上升（P<0.05）,AKT蛋白在1mg/kg剂量组、FOXO1蛋白2mg/kg剂量组表达上升（P<0.05）;在PND21时,0.5mg/kg剂量组foxo1 m RNA表达上升（P<0.05）,蛋白表达下降（P<0.05）,2mg/kg剂量组FSHR和AKT蛋白表达上升（P<0.05）;在PND56时,1mg/kg剂量组akt m RNA表达上升（P<0.05）,同样FOXO1蛋白表达上升（P<0.05）。1.2 F2代结果:与对照组相比,在PND21时,0.5、1mg/kg剂量组fshr m RNA表达下降（P<0.05）,PI3K蛋白在2mg/kg剂量组、FOXO1蛋白在1mg/kg表达上升（P<0.05）,但AKT蛋白在1mg/kg剂量组表达下降（P<0.05）;在PND56时,1、2mg/kg剂量组AKT、2mg/kg剂量组FOXO1蛋白表达上升（P<0.05）。1.3 F3代结果:与对照组相比,雄性大鼠在成年时,1mg/kg剂量组akt m RNA表达上升（P<0.05）,但2mg/kg剂量组foxo1的m RNA表达下降（P<0.05）,1mg/kg剂量组FSHR蛋白表达上升（P<0.05）。2、妊娠期镉暴露对子代大鼠睾丸DNA甲基转移酶的影响2.1 F1代结果:与对照组相比,雄性大鼠在PND5时,1mg/kg剂量组dnmt3a m RNA表达下降（P<0.05）,2mg/kg剂量组dnmt3b m RNA表达上升（P<0.05）,同时在2mg/kg剂量组DNMT3A、DNMT3B蛋白表达上升（P<0.05）;在PND21时,0.5mg/kg剂量组dnmt1、dnmt3a m RNA表达上升（P<0.05）;在PND56时,2mg/kg剂量组dnmt3a m RNA表达上升（P<0.05）,在1、2mg/kg剂量组DNMT3B蛋白表达上升（P<0.05）。2.2 F2代结果:与对照组相比,雄性大鼠在PND5时,2mg/kg剂量组DNMT1的蛋白表达上升（P<0.05）;在PND21时,1mg/kg剂量组dnmt3a m RNA表达下降（P<0.05）;在PND56时,0.5、2mg/kg剂量组dnmt3a的m RNA表达下降（P<0.05）。2.3 F3代结果:与对照组相比,雄性成年大鼠中,1mg/kg剂量组dnmt1 m RNA表达上升（P<0.05）,2mg/kg剂量组DNMT1、DNMT3B蛋白表达上升（P<0.05）,但是1、2mg/kg剂量组DNMT3A蛋白表达下降（P<0.05）。3、妊娠期镉暴露对子代大鼠睾丸FSHR/PI3K/AKT/FOXO1通路相关因子启动子区DNA甲基化水平的影响3.1 F1代结果:与对照组相比,雄性大鼠在PND21时,foxo1-14片段第65位点、foxo1-17片段第28、29位点剂量组甲基化水平下降（P<0.05）,在PND56时,akt-9片段第2位点剂量组甲基化水平下降（P<0.01）。3.2 F2代结果:与对照组相比,雄性大鼠在PND21时,fshr-8片段第4位点剂量组甲基化水平下降（P<0.05）,akt-33片段第12位点剂量组甲基化水平下降（P<0.05）,foxo1-15片段第21、22位点剂量组甲基化水平上升（P<0.05）。结论:1、妊娠期镉暴露可损伤子代睾丸组织和支持细胞结构,影响睾丸生长发育,各时期的改变并不延续性,但具有跨代毒效应;可干扰多代血清激素（Gn RH、FSH）的分泌及抑制F1代睾丸组织中的支持细胞FSHR蛋白表达,从而干扰睾丸组织支持细胞正常功能。其可能的主要机制是通过调控影响支持细胞增殖的FSHR/PI3K/AKT/FOXO1的通路相关因子的表达实现;2、妊娠期镉暴露可通过干扰各代各时期DNA甲基化转移酶（DNMT1、DNMT3A、DNMT3B）的表达影响睾丸组织DNA甲基化模式,具有跨代表观遗传效应;同时也改变fshr、akt、foxo1启动子区不同Cp G位点甲基化水平,但对三个基因的总体基因启动区甲基化水平没有影响,镉暴露后对子代fshr、akt、foxo1基因转录水平的影响可能并不是通过DNA甲基化修饰作用。