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分子印迹技术是模拟生物大分子之间及生物大分子与小分子之间的专一性结合制备人工抗体的一种新型技术。提高分子印迹的特异性结合能力一直都是此领域致力研究的重点,另外理性设计蛋白质分子印迹配方保证聚合时蛋白质的结构不受到损伤、性状保持稳定对蛋白质印迹聚合物的研究十分有意义。本文采用长链结构的丙烯酸10聚体和丙烯酸20聚体,采用凝胶包埋法制备了牛血红蛋白的分子印迹聚合物。本研究进行了以下工作并取得了相应结果:
首先采用等温滴定量热法来研究丙烯酸及其低聚物与血红蛋白之间的相互作用情况。通过等温滴定量热实验得知,当丙烯酸及其10聚体、20聚体的浓度在6.69、1.39、0.58mmol L-1以内时,能维持磷酸缓冲液的缓冲能力。丙烯酸及其低聚物功能单体在磷酸缓冲液中的反应常数Ka分别为1.6×104、1.3×103、9.2×102,丙烯酸20聚体的Ka值最小,表明长链上的羧基不容易达到完全解离。
其次考察功能单体的用量对血红蛋白的结构及功能的影响,进行了血红蛋白与功能单体相互作用的紫外分光检测实验。为保证血红蛋白在聚合时结构不被破坏,采用紫外吸光度变化不超过10%的标准确定功能单体与血红蛋白的比例用量,得出功能单体最佳比例为AA∶Hb=639∶1、AA10∶Hb=116∶1、AA20∶Hb=46∶1。将此比例下的功能单体-血红蛋白混合溶液进行圆二色谱的扫描,结果表明丙烯酸及其低聚物对血红蛋白的二级α-螺旋结构无破坏作用。
最后将四种功能单体与血红蛋白按最佳浓度比混合后制备分子印迹凝胶,考察丙烯酸单体及其低聚物制备印迹聚合物的吸附效果和识别性能。实验结果表明,丙烯酸及其10聚体、20聚体制备的印迹聚合物洗脱率分别达到41.9%、41.7%、45.2%。饱和吸附实验确定最佳重结合浓度为2×10-6mol L-1。考察不同pH下的印迹膜重结合情况,结果表明在pH6.4的条件下进行重结合实验得到印迹效果更好,丙烯酸及其10聚体、20聚体功能单体制备的印迹聚合物印迹效率分别为1.39、1.55、1.69,AA20制备的印迹膜印迹效率最高。在选择性评价中,丙烯酸20聚体制备的印迹膜对非模板蛋白的选择因子均较高,表现出其选择识别性较好。评价结果表明长链功能单体能够改善丙烯酸单体造成的高非特异性吸附的弊端,提高印迹聚合物的选择性识别效率。
首先采用等温滴定量热法来研究丙烯酸及其低聚物与血红蛋白之间的相互作用情况。通过等温滴定量热实验得知,当丙烯酸及其10聚体、20聚体的浓度在6.69、1.39、0.58mmol L-1以内时,能维持磷酸缓冲液的缓冲能力。丙烯酸及其低聚物功能单体在磷酸缓冲液中的反应常数Ka分别为1.6×104、1.3×103、9.2×102,丙烯酸20聚体的Ka值最小,表明长链上的羧基不容易达到完全解离。
其次考察功能单体的用量对血红蛋白的结构及功能的影响,进行了血红蛋白与功能单体相互作用的紫外分光检测实验。为保证血红蛋白在聚合时结构不被破坏,采用紫外吸光度变化不超过10%的标准确定功能单体与血红蛋白的比例用量,得出功能单体最佳比例为AA∶Hb=639∶1、AA10∶Hb=116∶1、AA20∶Hb=46∶1。将此比例下的功能单体-血红蛋白混合溶液进行圆二色谱的扫描,结果表明丙烯酸及其低聚物对血红蛋白的二级α-螺旋结构无破坏作用。
最后将四种功能单体与血红蛋白按最佳浓度比混合后制备分子印迹凝胶,考察丙烯酸单体及其低聚物制备印迹聚合物的吸附效果和识别性能。实验结果表明,丙烯酸及其10聚体、20聚体制备的印迹聚合物洗脱率分别达到41.9%、41.7%、45.2%。饱和吸附实验确定最佳重结合浓度为2×10-6mol L-1。考察不同pH下的印迹膜重结合情况,结果表明在pH6.4的条件下进行重结合实验得到印迹效果更好,丙烯酸及其10聚体、20聚体功能单体制备的印迹聚合物印迹效率分别为1.39、1.55、1.69,AA20制备的印迹膜印迹效率最高。在选择性评价中,丙烯酸20聚体制备的印迹膜对非模板蛋白的选择因子均较高,表现出其选择识别性较好。评价结果表明长链功能单体能够改善丙烯酸单体造成的高非特异性吸附的弊端,提高印迹聚合物的选择性识别效率。