褐藻胶降解菌株的筛选、鉴定及其产酶活性研究

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褐藻是我国主要的水产经济藻类。褐藻类细胞壁中含有大量褐藻多糖成分即褐藻胶,因其天然理化性质已被应用于众多领域。褐藻胶寡糖是褐藻胶水解后的产生的聚合度为20 DP以下的寡糖产物,具有抗菌、抗炎、抗衰老、促进生长等生物活性,已在食品、药品、日化等领域发挥重要作用。褐藻胶主要由化学、物理和生物法降解,其中生物降解法相比于前两种方法具有降解反应过程可控、天然产物活性高、对环境友好等优点,但目前市场上还没有可降解褐藻胶的专门发酵工程菌及褐藻胶裂解酶。主要原因是所筛选大部分可发酵降解褐藻胶的菌株多数存在产酶量低,酶活力不稳定,易失活等问题,还达不到工业生产要求。因此开发具有高酶活力褐藻胶降解菌株一直是重点研究方向,对于海洋资源的高值化利用具有重要意义。论文主要工作如下:(1)分别在仿刺参肠道、口虾蛄肠道、栉孔扇贝内脏、九孔鲍内脏和虾酱中取样,以海藻酸钠作为单一碳源配制培养基,以透明圈法定性初筛,DNS法复筛,从海洋生物中筛选得到一株高酶活性褐藻胶降解菌株B12,采用16S r DNA序列分析、生理生化实验、电镜观察,确定该菌为弧菌(Vibrio sp.)属。通过单因素试验及响应面优化试验对影响菌株生长和产酶条件的5个因素:发酵初始p H值、发酵温度、Na Cl质量浓度、接种量和装液量进行优化。获得了该菌株最优产酶条件为:p H6.52,28.20℃,Na Cl质量浓度为2.01%,接种量为2.10%,装液量为59.50 m L。在最优产酶条件下,B12菌株产酶活力可高达91.68 U/m L,相比于优化前提高了38.50%。菌株开始产酶时间提前了6 h,且于4℃冷藏保存酶活力稳定性较好。(2)对仿刺参进行实验室驯化培养、诱导仿刺参肠道菌群,采用海藻酸钠为唯一碳源配制培养基,利用透明圈法进行初筛,DNS法和紫外法复筛,从已驯化仿刺参肠道中筛选得到四株高酶活性褐藻胶降解菌株S1、S2、S10和S11,经16S r DNA序列分析、电镜观察,确定四株菌分别为芽孢杆菌属(Bacillus sp.)、微杆菌属(Microbacterium sp.)、弧菌属(Vibrio sp.)和微小杆菌属(Exiguobacterium sp.)。对该四株菌分别进行混合培养,获得S2与S11最佳配比组合,通过高通量微生物多样性检测分析混合菌株生长过程中菌群丰度的动态变化,并通过单因素试验及响应面优化试验对影响混合菌株产酶条件的4个因素:发酵初始p H值、Na Cl质量浓度、装液量和菌株混合培养温度进行优化。获得混合菌株发酵降解褐藻胶最优产酶条件为:混合发酵培养基初始p H为8.02,Na Cl质量浓度为40.71 g/L,装液量为79.73 m L,培养温度为27.96℃。在最优发酵条件下,混合菌株酶活力可达94.78 U/mL,相比于优化前提高了43.90%。
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