一、小鼠丘脑皮层上行传导通路的层特征和特异细胞选择性1.研究背景在哺乳动物中,感觉信息是经过丘脑整合后进一步上行投射到大脑皮层的。而在大脑,通常认为信息是经过了一系列的,不同层的分工,综合处理才完成的。大脑皮层的L4是丘脑主要信息的接收层,由突触将信息传递给L2/3 (layer2／3,L2/3)后,再进一步传递给L5/6 (Layer 5/6, L5/6)。然而,最近的多个研究结果显示,在感觉皮层,L5/6神经元可以直接被丘脑投射的纤维激活；不仅是L5/6,L2/3和L1 (Layer 1, L1)也有和L4 (Layer 4, L4)类似或者略迟延时的反应,表明可以被丘脑-皮层(Thalamocortical, TC)上行环路支配的区域不仅仅是L4,很可能比人们认识中的更加广泛,甚至可能存在皮层的层特征性。丘脑对皮层L4的投射已经是在离体脑片和在体技术中,被多次证实了的。在这些研究中,兴奋性和抑制性神经元的区分是可以通过注入一串电流,从放电类型上判断的。但是对不同抑制性神经元的区分研究,是最近才开始出现的。从之前少数几篇报道中,我们可以确定,弄清丘脑-皮层投射的细胞选择性和层特征性,对进一步了解丘脑-皮层环路的传递机制有着至关重要的作用。传统方法上,丘脑-皮层反应需要在丘脑-皮层脑片上,通过电刺激纤维记录。但电刺激往往会造成目标以外的纤维和神经元也同时被激活,因此本文采用光遗传学的方法进行研究。光遗传性是近年来逐渐兴起的一门新技术,主要用于长距离投射环路的研究。通过在哺乳动物神经元表面表达光感阳离子通道ChR2 (channelrhodopsin 2),该神经元可以被蓝色激发光以极其精准的方式激活,更重要的是,足够的ChR2可以在纤维和神经元的突触终末表达,并直接被蓝色激发光激活,从而释放神经递质,不需要上一级神经元的参与。因此,光遗传学的应用,可以以更精准的方式对远距离神经环路进行研究。在本篇文章中,我们通过使用可以标记不同神经元类型的转基因小鼠,在其丘脑位置注入光蛋白,使皮层神经元的突触终末表达ChR2的方法,从而实现对丘脑-皮层环路层特异性和细胞选择性的研究。2.结果本文采用离体脑片全细胞记录的方法,人工脑脊液中加入TTX循环给药,通过在不同转基因小鼠的A1 (Primary Audiotry Cortex, A1)和V1 (Primary Visural Cortex, V1)上,获得丘脑-皮层投射到小清蛋白阳性细胞PV(Parvalbumin,PV),生长激素抑制素阳性细胞SOM (Somatostatin, SOM),肠血管活性多肽阳性细胞VIP (Vasoactive Intestinal Peptide, VIP),PC(Pyramidal Cell, PC)以及L1抑制性神经元的单突触反应,测量这些神经元的相对反应幅度,结果发现：L4是主要接收TC上行投射的区域,这一点与之前的报道一致。对于兴奋性神经元,丘脑对其广泛的支配作用在所有层都存在,而对L4的支配强度是其它层的至少两倍。TC对PV和兴奋性神经元的支配模式非常相似,L4是它们接收投射最强的范围；而且不论在哪一层,它们的接收能力都远远大于其它神经元。这一结果很有力的说明,PV和兴奋性神经元是接收TC上行传递感觉信息的主要目标细胞。与PV和兴奋性神经元截然不同,SOM和VIP神经元几乎不接收TC的支配作用,只有在L4有30%左右的神经元表现出反应,而且该反应都非常弱,由此我们推测VIP和SOM神经元不太可能提供抑制性前馈作用,而更适合给兴奋性神经元提供抑制性反馈。此外,L1浅层区0-50umm区间的抑制性神经元也能接受丘脑的上行投射,该反应强度和L4兴奋性神经元相当；而深层区50-100umm区间的抑制性神经元并无响应,说明L1浅层区和深层区可能存在功能上的分工。而TC对皮层投射的层特异性,与皮层内树突上ChR2-EYPF表达的趋势有很好的相关性,表明丘脑投射纤维的强度很大程度决定了其对皮层投射的强度。虽然TC对皮层的投射存在层特异性和细胞选择性,但是丘脑对PV和兴奋性神经元支配作用的比值,在每一层都是相对恒定的,这说明,这种抑制前馈的强度,是根据丘脑对兴奋性神经元支配作用的强度进行调节的,从而保证整个皮层神经元对感觉信息的兴奋-抑制平衡。本文发现,TC对皮层投射的方式具有层特异性和细胞选择性,在A1和V1都以类似的方式存在,说明感觉信息从丘脑投射到皮层,都是以同样的方式进行整合处理的。3.结论综合上述结果,本实验得出下列结论：1)皮层L4和L3深层,是TC上行投射的主要目标区域。2)PV是接收TC直接支配作用最强的神经元,其次是PC；在所有层,这两类神经元都能接受TC的直接输入,PV神经元始终显示最强的反应。3)SOM和VIP神经元很少参与TC感觉信息的上行传递环路。仅在L4有少数神经元能接收TC输入,且该输入非常弱,其它层均无反应。4)L1抑制性神经元能够接收TC直接支配,这种支配强度和Pyramidal相当。但仅存在于L1浅层0-50um区间,L1深层50-100um区间神经元对该输入无响应。二、小鼠初级听皮层内部调控环路的层特征和特异细胞选择性1.研究背景在大脑皮层,存在有多种抑制性神经元,根据它们的形态,分子标记物,电生理特性,以及投射模式的不同,可以将这些抑制性神经元分类并识别,这其中最主要的有三种：PV,SOM以及VIP神经元。PV神经元占全部抑制性神经元总数的40%,有篮状和灯形两种主要形态。PV的动作电位时程短,放电频率高,后超级化快,输入阻抗低,呈典型的快放电模式,被认为是在局部环路中,能够提供抑制性输入的主要来源。在皮层内部环路中,PV神经元主要提供抑制性输入给其它PV神经元,对局部周围的兴奋性神经元具有优先支配作用。其主要的兴奋性输入来源为L2/3,L4和L5；主要的抑制性输入来源为L2/3和L4。SOM神经元分布在皮层的L2/3到L6,且分布数量随着皮层深度的增加而增加,其放电多为规律性、适应性,输入阻抗低,后超级化较快。SOM神经元主要的兴奋性输入来源是L2/3和L4,主要的抑制性输入来源也是L2/3和L4,且在不同层这种输入来源的强度无显著性差异。在体感中枢,SOM神经元是以“开关”模式存在并发挥作用的,当小鼠没有参与体感活动时,SOM神经元以安静状态作用于局部L2/3的PCs远端树突末梢,一旦小鼠开始体感运动,这种作用便开启,给予抑制性输入于兴奋性神经元。而VIP神经元在皮层L2/3分布最多,放电模式也比较多样化,呈规律性或爆发性放电,有较高的易兴奋性。VIP神经元可以在局部环路上,以双突触抑制的方式,对其它多种GABA能抑制性神经元的活动进行调控,其中优先支配SOM。其主要兴奋性和抑制性输入来源均是L2/3。在光遗传学广泛应用之前,人们对神经网络连接方式的研究很多都是从在体实验结果中推测出来的,却没有直接证据对其证明。近年来,随着光遗传学和转基因动物结合方法的普遍应用,人们对神经网络的连接方式的研究也越来越精细。但从报道结果上看,人们大多倾向于探究抑制性神经元的兴奋性输入来源,或是与其它抑制性神经元之间的连接关系,并且没有对不同兴奋性神经元系统地区分研究,仅仅是根据不同放电模式进行分类判别,对听皮层这方面的研究更是少之又少。据我们所知,本文是第一个系统的将抑制性神经元通过用转基因动物的方法加以分类,并分层研究的方式,对听皮层内部神经元网络连接模式报道的文章。在本篇文章中,我们通过使用可以标记不同神经元类型的转基因小鼠,在其听皮层位置注入光蛋白,使皮层内所有层的不同抑制性中间神经元的表面均分别表达ChR2,分别刺激不同层不同抑制性神经元,同时记录不同层兴奋性椎体神经元突触后反应的方法,实现对皮层内局部环路层特异性和细胞选择性的研究。2.结果本文采用离体脑片全细胞记录的方法,使听皮层所有层的PV, SOM, VIP神经元表面分别均表达光感通道ChR2-EYFP,通过垂直移动80um直径的蓝光光圈,使之分别刺激听皮层垂直柱内的每一层抑制性神经元,记录不同层的兴奋性椎体神经元抑制性突触后电流(Inhibitory Postsynaptic Current, IPSC),探究在听皮层内,不同抑制性神经元对兴奋性椎体细胞的支配模式。结果显示,PV神经元在听皮层垂直柱内的跨层投射范围最小,几乎仅对本能内的兴奋性椎体神经元提供抑制性输入。相比之下,SOM和VIP神经元的跨层输入范围非常广泛,在所有跨层反应中,L4和L5的兴奋性椎体神经元接收的所有抑制性输入来源最为广泛。这给我们提供了一个新的信息,L5不仅参与将听觉信息传到低位中枢,在听皮层内部对声音信号整合上也发挥了很大作用。通过比较不同抑制性神经元提供的IPSC幅度,我们还发现所有抑制性中间神经元对本层内的兴奋性神经元支配强度最强,这一点在和之前的报道结果一致。通过在同一水平层内移动光圈,以此刺激距离记录兴奋性神经元胞体不同距离的抑制性神经元,结果发现,在同一层内,PV神经元能够给椎体神经元提供的抑制性输入距离最短,距离所记录神经元100um的PV细胞,几乎不提供IPSC;而SOM神经元提供的输入范围最广泛,最远距兴奋性神经元300um的SOM细胞仍然具有支配作用,400um时,才这种支配作用才完全消失VIP神经元在同一水平层内的支配能力介于这二者之间,最远可到200um。但和SOM、VIP神经元相比,PV所能提供的抑制性输入强度是最强的。结合第一部分实验结果,我们认为,PV、SOM、VIP三种抑制性中间神经元在感觉信息的处理方式上有很大不同。PV神经元作为主要的丘脑-皮层上行信息接收者,它主要参与远距离感觉信息的处理,而在皮层内部,PV提供的跨层抑制性输入以及同一水平层内的抑制性输入范围都非常小,说明PV较少参与对皮层内部信息处理。相比之下,SOM和VIP神经元对远距离的感觉信息整合几乎无作用,但在听皮层内部,二者的跨层输出范围非常多,在同一水平层内的抑制性输出距离也远大于PV,说明SOM和VIP神经元的主要作用是对感觉信息在皮层内部的整合处理。此外,和PV神经元相比,SOM和VIP提供的抑制性输出强度比较弱,我们认为,这种比较弱的输出更有利于SOM和VIP实现在皮层内部对感觉信息的精细调控。3.结论综合上述结果,本实验得出下列结论：1)在听皮层,PV神经元的跨层输出范围很小,几乎仅对本层内的兴奋性椎体神经元提供抑制性输入,但这种输入强度远远强于VIP和SOM神经元。2)SOM和VIP神经元在A1的跨层投射作用比较广泛,其中L4和L5的兴奋性神经元接受到的跨层抑制性输入来源最多。3)在同一水平层内,PV神经元能够提供的抑制性输出范围最短,最远能够支配100um远的兴奋性神经元；SOM神经元提供的输入范围最广泛,最远可到300um；VIP神经元在同一水平层内的支配能力介于这二者之间,最远可到200umm。4)PV神经元更多的功能是参与远距离感觉信息的输入,对皮层内部信息整合的作用较少,但是其抑制性输出是最强的；与PV神经元相反,SOM和VIP主要参与听觉信息在皮层内部的处理,抑制性输出的强度较弱,但跨层输出范围非常广泛,对远距离感觉信息整合的作用较少。