研究背景炎症性肠病（inflammatory bowel disease,IBD）是一种慢性炎症性的肠道疾病,在普通人群中的发病率接近0.3%,且呈逐年增加趋势。根据发病特征和部位不同,IBD主要分为溃疡性结肠炎（ulcerative colitis,UC）和克罗恩病（Crohn’s disease,CD）。其中,UC主要表现为直肠向近端不同程度扩散的弥漫性肠道黏膜炎症。目前UC的病因及发病机制尚未明确,肠上皮屏障功能障碍导致的肠道内稳态失衡被认为是UC潜在的发病机制之一。作为肠道屏障的主要细胞实体,肠道上皮细胞（intestinal epithelial cells,IECs）对维持肠道平衡至关重要。了解IECs在UC发生发展中的作用,有助于提高对UC炎症过程的认识和确定潜在的治疗目标。鸢尾素（Irisin）被认为是一种新的肌肉因子,由Ⅲ型纤维连接蛋白结构域5（FNDC5）蛋白裂解产生,在人类和小鼠之间具有100%的同源性。FNDC5/Irisin已被证明可以在不同的疾病中发挥其多效作用。近年来多项研究表明FNDC5/Irisin可能是炎症性疾病病理生理过程中的关键因子,但是FNDC5/Irisin对于UC,特别是活动期UC的作用以及潜在的作用机制仍不明确。在本研究中,我们首先明确了 FNDC5/Irisin在UC患者以及小鼠模型外周血和肠道组织中的表达情况;随后,我们评估了 FNDC5/Irisin敲除后的结肠炎小鼠模型在肠道炎症、肠上皮屏障、线粒体功能等方面的表型改变;此外,我们还观察了外源性Irisin对结肠炎小鼠模型、结肠类器官以及肠上皮细胞系的上述表型变化,并对其机制进行探讨。研究方法和实验结果（一）FNDC5/Irisin在UC患者及结肠炎小鼠模型中的表达存在差异1、FNDC5/Irisin在UC患者外周血中表达升高,但在肠道组织中表达下降本研究课题共招募了 35名被明确诊断为UC的患者以及33名健康志愿者,对外周血Irisin的表达情况进行检测。结果表明,在中、重度活动期UC患者的外周血中,Irisin的表达水平明显升高,且重度活动期患者血清中Irisin表达水平要高于轻度活动期患者。Western blot的结果显示,FNDC5/Irisin在UC患者肠道炎症组织中的表达显著下降。2、FNDC5/Irisin在结肠炎小鼠模型外周血中表达升高,但在肠道组织中表达下降通过DSS自由饮水法构建结肠炎小鼠模型,ELISA结果表明,相比于正常组小鼠,Irisin在结肠炎小鼠模型外周血中表达明显升高,而在肠道组织中的表达下降,无论是mRNA水平亦或是蛋白水平。（二）敲除FNDC5/Irisin显著缓解结肠炎小鼠模型的肠道炎症以及肠上皮屏障功能障碍1、FNDC5/Irisin敲除缓解了结肠炎小鼠模型的肠道炎症与野生型DSS组小鼠相比,FNDC5-/-+DSS组小鼠体重的下降幅度减少、DAI评分降低、结肠长度更长。通过RT-PCR、ELISA以及HE染色的方法对小鼠结肠炎症进行评估,发现与野生型DSS组小鼠相比,FNDC5/Irisin基因敲除减轻了结肠炎小鼠模型结肠组织结构的破坏以及炎症因子的表达。2、FNDC5/Irisin敲除改善了结肠炎小鼠模型的肠道上皮屏障损伤我们通过RT-PCR、Western blot以及免疫荧光的方法检测了紧密连接蛋白Occludin以及粘附连接蛋白E-Cadherin的表达水平。结果表明,相比于野生型DSS组,FNDC5-/-+DSS组中Occludin和E-Cadherin的表达升高;小鼠结肠组织切片的AB-PAS染色结果显示,相比于野生型DSS组,FNDC5-/-+DSS组小鼠黏蛋白增多,黏液屏障损伤程度减轻;FITC-Dextran的实验结果表明,FNDC5-/-+DSS组小鼠肠道渗透性较DSS组下降,表现为外周血中FITC-Dextran的含量降低。3、FNDC5/Irisin敲除减轻了结肠炎小鼠模型肠道细胞凋亡、ROS含量以及线粒体的损伤小鼠结肠组织切片TUNEL染色以及Western blot的结果显示,相比于野生型DSS组,FNDC5-/-+DSS组小鼠肠道凋亡细胞的数量减少,凋亡关键蛋白cleaved-caspase3与Bax的表达降低,Bcl-2的表达升高;DHE染色以及抗氧化酶的含量检测结果发现,与野生型DSS组相比,FNDC5-/-+DSS组小鼠肠道ROS以及MDA的含量下降,而抗氧化酶SOD、GSH-PX、CAT等的表达升高;因此,我们将关注点放在了 FNDC5/Irisin对肠道细胞线粒体功能的影响方面。对小鼠肠道组织ATP含量的测定结果表明,与野生型DSS组相比,在FNDC5-/-+DSS组中ATP的含量升高;透射电镜结果显示,FNDC5-/-+DSS组小鼠线粒体损伤程度明显较DSS组轻。（三）Irisin通过诱导线粒体ROS生成,促进上皮细胞凋亡,加重肠上皮屏障功能障碍及肠道炎症1、外源性补充Irisin加重了结肠炎小鼠模型的肠道炎症为了明确Irisin对UC的直接影响,我们在DSS造模的同时予以小鼠重组Irisin蛋白腹腔注射,结果显示,外源性补充Irisin使得DSS组小鼠体重进一步下降,DAI评分明显升高,结肠长度进一步缩短;同时,通过对肠道组织HE染色以及炎症因子表达水平的检测结果来看,Irisin腹腔注射进一步破坏了结肠组织结构,促进了炎症因子的表达。2、外源性补充Irisin进一步加重肠道上皮屏障损伤RT-PCR、Western blot和免疫荧光的结果表明,相比于DSS组,DSS+Irisin组中肠道紧密连接蛋白Occludin以及粘附连接蛋白E-Cadherin表达继续降低,部分绒毛的紧密连接结构完全消失;AB-PAS染色结果表明,Irisin腹腔注射进一步加重了小鼠结肠黏液屏障的损伤;FITC-Dextran的实验结果表明,FNDC5-/-+Irisin组小鼠肠道渗透性较DSS组进一步升高,表现为外周血中FITC-Dextran的含量升高。3、Irisin体外处理抑制了肠上皮细胞的增殖并加重了上皮屏障功能损伤为了在体外进一步明确Irisin对肠上皮细胞的影响,我们通过TNF-α/IFN-γ刺激Caco-2细胞系以及结肠类器官以构建体外肠上皮炎症损伤模型。CCK-8结果显示,高浓度的Irisin处理进一步降低了 Caco-2细胞的存活率;在结肠类器官中,免疫荧光以及Western blot结果显示,在肠上皮炎症损伤的背景下,高浓度Irisin处理进一步抑制了结肠类器官的增殖与存活,并破坏了肠上皮屏障的完整性。4、Irisin通过诱导线粒体ROS生成,促进肠上皮细胞凋亡在小鼠水平,我们通过TUNEL染色以及Western blot检测,发现Irisin腹腔注射促进了结肠炎小鼠模型肠道细胞的凋亡;抗氧化酶检测和DHE染色的结果显示,Irisin进一步促进了结肠炎小鼠模型肠道上皮细胞内ROS及其代谢产物MDA的生成;在结肠类器官以及Caco2细胞系水平,通过TUNEL染色、凋亡关键蛋白的Western blot检测以及流式细胞计数、我们也得到了类似的结论,即高浓度的Irisin在炎症损伤的背景下促进了肠上皮细胞的凋亡。随后,我们通过DCFH-DA、MitoSOX以及MitoTracker染色的方法对肠上皮细胞内线粒体活性以及ROS含量进行了评估,结果显示高浓度Irisin处理降低了肠上皮细胞内线粒体的活性,并促进了线粒体ROS的生成。（四）FNDC5/Irisin通过与受体整合素αV/β5结合,激活p38 MAPK-NF-κB通路,促进肠上皮细胞凋亡1、FNDC5/Irisin受体整合素αV/β5主要在肠道上皮细胞表达,且在UC状态下表达升高我们首先通过Western blot以及免疫荧光的方法对结肠炎小鼠模型肠道组织中整合素αV/β5的表达水平进行了检测,结果表明,整合素αV/β5分子主要在肠上皮细胞中表达,且在结肠炎小鼠模型的肠道组织中表达升高。同样,与健康志愿者相比,在UC患者肠道组织中,整合素αV/β5的蛋白表达水平也明显升高。2、Irisin受体整合素αV/β5在TNF-α/IFN-γ诱导处理后表达升高通过Western blot的方法,我们对Irisin受体整合素αVβ5的表达进行检测,结果显示在Caco-2细胞系以及结肠类器官中,整合素αVβ5的总体表达水平在受到TNF-α/IFN-γ刺激后表达升高。这一结果也提示,Irisin是通过整合素αVβ5介导而发挥肠上皮细胞调控作用。3、结肠炎小鼠模型肠上皮细胞转录组分析我们分离提取了 Control组、野生型DSS组、FNDC5-/-组以及FNDC5-/-+DSS组小鼠的结肠上皮细胞,并进行了转录组测序分析,差异基因功能富集分析的结果显示,FNDC5/Irisin敲除在UC中主要影响了肠上皮细胞ROS应答以及凋亡调控等功能;KEGG和GSEA通路富集分析则提示MAPK以及NF-κB信号通路可能是FNDC5/Irisin调控UC肠上皮细胞功能的潜在关键通路。4、Irisin通过激活p38 MAPK以及NF-κB,促进肠上皮细胞凋亡我们在小鼠以及类器官水平对p38 MAPK以及NF-κB分子的磷酸化水平进行了验证,发现p38 MAPK以及p65 NF-κB的磷酸化水平在FNDC5/Irisin敲除的结肠炎小鼠肠道上皮细胞中表达下降。在结肠类器官中,Irisin处理则在TNF-α/IFN-γ刺激的背景下进一步促进了上述分子的磷酸化,而p38-MAPK抑制剂则部分逆转了TNF-α/IFN-γ及Irisin联合处理导致的类器官细胞凋亡。研究结论FNDC5/Irisin在UC患者以及结肠炎小鼠模型外周血中表达升高,且Irisin可以在结肠炎症的情况下通过与受体整合素αVβ5的结合,靶向并作用于肠上皮细胞中的线粒体,加重线粒体损伤并促进ROS生成,激活p38 MAPK-NF-κB通路并促进肠上皮细胞的凋亡,进而破坏肠上皮屏障功能。