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猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp）是支原体属中的一个重要成员,其可以引起猪的地方性肺炎（Enzootic Pneumonia,EP）。EP是一种慢性呼吸道疾病,各个年龄阶段的猪都能够被感染,临床症状表现为咳嗽和气喘﹑消瘦,导致猪生长性能﹑饲料转化率显著降低,给养殖业造成巨大经济损失。Mhp自上个世纪六十年代年首次被鉴定以来,目前已经在世界范围内广泛流行和传播,根据Thacker等人的研究进展,气喘病的全球流行率在38%～80%之间。国内统计数据表明,我国南方省份的气喘病血清阳性率处在0%～90%之间。疫苗在防控Mhp的感染中具有重要作用,一般认为,灭活疫苗可以降低Mhp引起的肺损伤,但不能完全清除Mhp在肺内的定居,而活疫苗虽然具有很好的免疫保护效果,但有的需要进行肺内注射免疫,其免疫方式临床操作麻烦,具有一定的局限性。为了研究开发具有高保护效果而又使用方便的Mhp弱毒疫苗,本实验室前期在湖北恩施黑猪中分离出一株高致病性猪肺炎支原体ES-2株,具有生长速度快、滴度高、免疫保护性强的特点。我们以此为研究基础,进行Mhp ES-2株的体外连续传代,对不同代次的传代株进行生物学特性研究和毒力评估。并通过不同的免疫方式和免疫剂量来评估Mhp ES-2L株的免疫保护效果。现将具体结果简汇如下。1.Mhp ES-2株的体外传代及致弱株的筛选将猪肺炎支原体ES-2株在改良Friis液体培养基中于37℃、5%CO2环境条件下进行连续传代,并将得到的P200代菌命名为ES-2L株。ES-2L株具有生长速度快﹑滴度高的优点,其CCU最高可达1×1010CCU/m L。将P1（ES-2株）﹑P80﹑P120﹑P200代（ES-2L株）分别以7×10~8CCU/头的剂量进行气管内注射感染仔猪,结果表明,P1代感染组有4头猪肺脏（4/4）出现典型“肉样或虾肉样”病变,肺脏病理切片出现严重的单核细胞、淋巴细胞的浸润;P80代感染组有2头猪肺脏（2/4）出现猪肺炎支原体特征性病变;P120代感染组有1头猪肺脏（1/4）出现“肉样或虾肉样”病变;P200代感染组没有出现典型猪肺炎支原体特征性病变,肺脏病理切片也没有出现炎性细胞的浸润。病变评分表明,P1代感染组的平均得分为10分,ES-2L株感染组的平均得分为1.25分,二者具有显著性差异。以上结果说明,相比于P1代株及P80代和P120代株,ES-2L株的毒力有明显的下降。2.ES-2L与ES-2株的比较基因组学及比较蛋白质组学分析为了更好的解释ES-2和ES-2L株在生长代谢﹑毒力方面的差异,对ES-2L株进行全基因测序及二者间的比较基因组学分析,结果表明,相对于ES-2株,ES-2L株共计存在9个大片段,18个基因的缺失。348个SNVs和22个Indel主要分布于ES-2L的118个基因中,而这些缺失或变异的基因可能与ES-2L株的毒力下降及生长特性改变有关。ES-2和ES-2L株的比较蛋白质组学分析结果表明,共计鉴定到163个差异蛋白,其中,在上调蛋白中,与基因合成﹑物质转运相关蛋白有明显的高表达。在下调蛋白中,与甘油及肌醇代谢等相关蛋白的表达量有明显的下调,且这些蛋白已被证实与Mhp的毒力有很紧密的联系。这些测序结果也说明了ES-2L是一株生长滴度高﹑低毒力的疫苗候选株。3.猪肺炎支原体ES-2L株的免疫保护效果评估我们对ES-2L株进行肌肉注射和肺内注射两种免疫方式的免疫效果比较评估。结果表明,攻毒对照组有5头猪肺脏（5/5）出现典型“肉样或虾肉样”病变,肌注免疫组有1头猪肺脏（1/5）出现猪肺炎支原体特征性病变,肺内免疫组有1头猪肺脏（1/5）出现“肉样或虾肉样”病变,两个免疫组的平均肺炎病变减少率分别为85.4%﹑83.6%,均具有良好的免疫保护效果,考虑到临床使用的方便性,确定了以肌肉注射免疫作为其免疫方式。确定免疫方式后,随后对ES-2L株进行不同免疫剂量（2×10~7CCU/头份﹑2×10~6CCU/头份﹑2×10~5CCU/头份）的免疫效果评估,并和商业化疫苗进行对比。结果表明,攻毒对照组有5头猪肺脏（5/5）出现“肉样或虾肉样”病变,2×10~7CCU和2×10~6CCU免疫组分别有1头猪肺脏（1/5）,2头猪肺脏（2/5）出现“肉样或虾肉样”病变,二者的肺炎病变减少率分别为85.1%,80.8%,均具有很好的免疫保护效果;商业化疫苗组有1头猪肺脏（1/5）出现“肉样或虾肉样”病变,其肺炎病变减少率分别为82.9%。其中2×10~7CCU免疫组的保护效果可以达到商业化疫苗组的保护效果水平。为了确保临床使用的免疫效果,在后续的疫苗研发中,推荐以2×10~7CCU/头份作为其免疫剂量。综上,通过对ES-2株进行体外连续传至200代,得到了一株传代株ES-2L株,通过动物毒力实验评估和比较基因组学及蛋白质组学的方法证实了ES-2L是一株生长滴度高﹑低毒力的菌株。并确定了其作为疫苗的免疫方式:肌肉注射免疫和以2×10~7CCU/头份作为其免疫剂量。为后续弱毒疫苗的研发及气喘病的临床防控奠定了基础。