肉鸡胫骨软骨发育不良（Tibial Dyschondroplasia,TD）常发生于生长周期短,体型较大肉鸡中的一种代谢性紊乱的骨骼疾病。肉鸡TD的临床表现以站立困难、运动障碍、生长性能下降、腿部骨骼畸形为特征,其典型的病理学特征为胫骨近干骺端生长板中出现无血管化、未钙化的透明“软骨栓”,生长和分化异常的生长板软骨细胞大量堆积。本课题组问卷调查显示,近几年在我国部分肉鸡养殖大省中,TD的综合发病率约为5%。由于TD的致病原因和发病机制复杂多样,且常表现为亚临床症状,再加上近几年肉仔鸡饲料的严重污染,不仅对诊断和治疗TD的一线科研工作者造成困扰,还给我国肉鸡养殖业造成巨大的经济损失。课题组前期已经证实,TD发生后的胫骨生长板中存在大量的差异性表达的miRNA及其靶基因。为了深入探究差异性表达的miRNAs在TD中的发病原因、发病过程中的调控作用,本研究以原代生长板软骨细胞为试验模型,通过体外细胞试验揭示miR-140-5p及其靶基因对生长板软骨细胞的生长、分化的作用机制,利用福美双诱发肉鸡TD为试验模型,通过体内动物试验研究骨碎补总黄酮对TD的治疗作用和对miRNA表达变化的影响,旨为探明TD发病机制和评估中药防治效果。具体的研究内容及结果如下:1.原代生长板软骨细胞的分离和培养方法（机械-双酶法）的建立及评估家禽长骨的生长和发育是由软骨细胞和软骨基质组成高度组织化的生长板来完成的,因此从胫骨生长板中精确分离软骨细胞并大量培养不仅能为本研究提供了充足的细胞样本,并且为下一步探究软骨细胞的生长、分化提供必要条件。本研究采用透明质酸酶配合Ⅳ型胶原酶消化的方式,从生长板中获取软骨细胞。通过台盼蓝染色检测细胞的存活率,通过甲苯胺蓝染色、细胞免疫荧光（Col-Ⅱ、Aggrecan）和PCR进行软骨细胞的鉴定,通过血球计数法和CCK-8法检测软骨细胞的生长并绘制生长曲线,并通过细胞纯度、活细胞数和总细胞数来评估不同软骨细胞分离和培养的方法。结果显示,机械双酶法分离的细胞为生长板软骨细胞,细胞的存活率高于98%,且软骨细胞正处于增殖期均未分化。对比分析不同软骨细胞分离和培养的方法,该方法分离的生长板软骨细胞具有数量充足,无杂细胞,活力良好等优点,并且成功将软骨细胞传至第三代。综上所述,机械双酶法是目前较为成熟的原代生长板软骨细胞分离和培养方法,不仅为本研究提供了充足的试验样本,还为其它原代细胞的分离和培养积累了实践经验。2.miR-140-5p在生长板软骨细胞中的功能研究miRNA参与生物体发育、细胞生长、分化、凋亡和代谢等多种功能的进程,通过二代测序技术在转录水平检测表明,miRNA的表达程度在正常发育的动物和发育异常的病畜间都存在显著性差异。前期的高通量测序结果发现,miR-140-5p的表达在TD肉鸡胫骨生长板中显著性降低,但miR-140-5p在生长板软骨细胞中发挥的功能尚不明确。因此,本研究首先通过RT-qPCR在福美双诱发肉鸡TD的动物模型上验证miR-140-5p在生长板的表达变化和不同组织的表达谱。LV3-miR-140-5p mimics和LV3-miR-140-5p inhibitor同时转染软骨细胞,通过细胞外部形态的变化和软骨细胞生长、分化的标志物的表达变化来检测miR-140-5p对软骨细胞的功能影响。结果显示,相比于正常组,miR-140-5p的表达量在TD组显著性降低（p＜0.05或p＜0.01）,与miRNA测序结果一致。且miR-140-5p在肉鸡胫骨生长板的表达量极显著高于肉鸡的内脏器官、皮肤和肌肉（p＜0.01）,具有组织表达特异性。转染72h后,对照组的软骨细胞外部形态呈卵圆形,细胞轮廓清晰,排列紧密;mimics组的软骨细胞外部形态呈“铺路石”状,细胞形态一致且分布均匀;inhibitor组的软骨细胞外部形态不一,细胞轮廓模糊。相比于对照组,NC组和inhibitor组,过表达miR-140-5p组的软骨细胞特异性分泌标志物Col-Ⅱ、Sox9的表达量显著性上调（p＜0.05或p＜0.01）,促软骨细胞分化标志物MEF2C、Runx2和软骨细胞肥大期标志物Col-X、COMP、IHH、MMP-13和VEGFA的表达量都显著性上调（p＜0.05或p＜0.01）,但是miR-140-5p潜在的靶基因HDAC4的表达量降低（p＜0.05或p＜0.01）。研究结果表明,过表达miR-140-5p促进了生长板软骨细胞的生长和分化,沉默miR-140-5p的表达,导致软骨细胞生长处于停滞状态,无法分化为成熟的软骨细胞。3.miR-140-5p在生长板软骨细胞中作用的机制研究miRNA在动物机体中是通过与靶mRNA碱基不完全结合,引导沉默结合序列并阻碍下一步的翻译进程或直接促使靶序列降解从而发挥重要的调控作用。组蛋白去乙酰化酶4（HDAC4）是miR-140-5p潜在的靶基因,研究发现HDAC4通过结合促软骨细胞分化因子并抑制其活性,调控软骨细胞的肥大及软骨内成骨的进程。然而,miR-140-5p与HDAC4是否存在直接的靶向关系,HDAC4影响软骨细胞的生长和分化的潜在机制都是未知的。为此,本研究通过双荧光素酶报告基因试验验证miR-140-5p与HDAC4的靶向关系;通过免疫共沉淀试验筛选与HDAC4的互作蛋白;通过HDAC4的特异性抑制剂和激动剂分别处理软骨细胞,检测HDAC4与其互作蛋白的调控关系。通过促软骨细胞分化,检测软骨细胞在培养过程中miR-140-5p、HDAC4及其互作蛋白的动态表达变化。结果显示,miR-140-5p mimic和HDAC4-WT结合显著性降低了荧光活性（p＜0.01）;HDAC4与Col-Ⅱ、Col-X和COMP存在互作关系;与其它组相比,HDAC4抑制剂组中促软骨细胞分化因子Runx2、MEF2C 和软骨细胞肥大标志物 Col-X、COMP、IHH、MMP-13、VEGFA的表达量都显著性上调（p＜0.05或p＜0.01）;软骨细胞在促分化培养的条件下,Runx2、MEF2C、Col-X、COMP、IHH、MMP-13和VEGFA等的表达量都有不同程度的上调,HDAC4的表达量处于一直下调的状态（p＜0.05或p＜0.01）。研究结果表明,miR-140-5p直接靶向并抑制HDAC4。HDAC4与Col-Ⅱ、Col-X和COMP存在互作并抑制软骨细胞分化,抑制膜内成骨靶蛋白BMP2,软骨内成骨信号通路IHH/PTHrP,和血管内皮生长因子VEGFA的表达。在软骨细胞生长、分化过程中Sox9、BMP2、Runx2、MEF2C、Col-X、MMP-13、COMP和VEGFA起到了关键性正向调控的作用。4.骨碎补总黄酮对肉鸡胫骨软骨发育不良的作用研究骨碎补总黄酮是一种传统的中草药,常用于防治骨质疏松、骨折等其他骨骼疾病,但骨碎补总黄酮对TD是否有治疗作用尚未报道。因此,为探讨骨碎补总黄酮对肉鸡TD是否具有治疗作用,本研究将320只AA白羽肉鸡随机分为对照组、TD组（50mg/kg福美双诱发TD）、TDR组（自我恢复组）、骨碎补总黄酮组（20 mg/kg/day）。通过临床表现、生长性能、胫骨参数、生长板软骨细胞的发育和血管的生成等评估骨碎补总黄酮的治疗作用。通过RT-qPCR和Western-blot检测膜内成骨的关键因子BMP2/Runx2、软骨内成骨关键因子IHH/PTHrP、miR-140-5p及其靶基因的表达来分析骨碎补总黄酮的作用机制。结果显示,骨碎补总黄酮对TD肉鸡的生长性能、临床表现、胫骨参数、生长板中软骨细胞和血管都有着较好的改善效果。骨碎补总黄酮组中BMP2/Runx2、IHH/PTHrP、miR-140-5p及软骨细胞肥大标志物（Col-X、COMP、MMP-13、VEGFA）的表达水平都有着不同程度的上调（p＜0.05,p＜0.01）,但是HDAC4的表达一直处于下调状态（p＜0.05或p＜0.01）。研究结果表明,骨碎补总黄酮对福美双诱发的TD有着良好的治疗作用,它正向调控膜内成骨和软骨内成骨信号轴,能上调miR-140-5p的表达,且下调HDAC4的表达。骨碎补总黄酮能促进生长板软骨细胞的生长、分化和生长板血管的生成和入侵。综上,骨碎补总黄酮可以作为治疗TD的潜在药物。