【摘 要】
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弓形虫是顶复门原虫中危害严重的人畜共患寄生虫。弓形虫的棒状体、微线体和致密颗粒等特殊细胞器产生的分泌蛋白在弓形虫的入侵、复制及免疫逃避等方面发挥着重要作用。真核生物的分泌蛋白和膜结合蛋白的折叠、降解以及多种翻译后修饰均需要在内质网中以ATP作为能量来源或者辅助因子参与其中。但是ATP作为核苷酸大分子无法直接穿过生物膜系统进入内质网,因此需要专门的转运蛋白将其转入内质网,同时将分解产生的ADP转出内
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弓形虫是顶复门原虫中危害严重的人畜共患寄生虫。弓形虫的棒状体、微线体和致密颗粒等特殊细胞器产生的分泌蛋白在弓形虫的入侵、复制及免疫逃避等方面发挥着重要作用。真核生物的分泌蛋白和膜结合蛋白的折叠、降解以及多种翻译后修饰均需要在内质网中以ATP作为能量来源或者辅助因子参与其中。但是ATP作为核苷酸大分子无法直接穿过生物膜系统进入内质网,因此需要专门的转运蛋白将其转入内质网,同时将分解产生的ADP转出内质网。弓形虫作为具有专业分泌能力的寄生原虫,理论上其内质网需要大量的ATP参与分泌蛋白的加工折叠,但是目前关于弓形虫胞质ATP如何进入内质网以及在弓形虫生长过程中发挥何种作用仍不清楚。本研究通过多种方法鉴定到一个定位于弓形虫内质网的ATP/ADP转运蛋白,并对其功能进行了研究。主要研究内容如下:（1）弓形虫内质网ATP/ADP转运蛋白的筛选目前关于内质网ATP/ADP转运蛋白仅在海拉细胞（AXER）及拟南芥（ER-ANT1）中有相关研究,使用AXER和ER-ANT1的蛋白序列在弓形虫数据库ToxoDB中搜索到的同源蛋白均定位于线粒体中。使用ToxoDB中的筛选功能,以跨膜结构域（≥6）和CRISPR表型值（≤-3）为筛选条件成功筛选到一个潜在的内质网ATP/ADP转运蛋白TgGT1-254580,在ToxoDB中该蛋白被命名为UDP-半乳糖家族蛋白（UDP-galactose transporter family protein）,C-端具有典型的多赖氨酸（-KKQC）内质网定位信号,这种序列被认为是内质网定位的关键序列。通过定位实验证明该蛋白定位于弓形虫内质网并将其命名为TgANT。（2）弓形虫内质网ATP/ADP转运蛋白TgANT的转运能力及底物特异性验证利用大肠杆菌表达系统,将TgANT在大肠杆菌中异源表达,并使用[α-32P]ATP对TgANT的转运能力进行验证。结果表明TgANT对ATP和ADP具有很高的亲和力,并且具有很高的底物特异性,不转运ATP和ADP之外的其他底物,反向转运实验证明TgANT具有和线粒体ATP/ADP转运蛋白相同的反向转运能力。使用Lec8细胞对TgANT的UDP-半乳糖转运能力进行检测,发现其不具有UDP半乳糖转运能力。（3）弓形虫内质网ATP/ADP转运蛋白TgANT对弓形虫体外生长的影响由于TgANT具有非常低的CRISPR表型值（-4.9）,表明该基因对弓形虫的生长必不可少,不能直接敲除,因此使用Teto/off条件性敲除技术对TgANT进行表达调控。实验结果表明TgANT的缺失导致弓形虫出现严重的生长缺陷包括复制能力显著减缓,不形成可视化的空斑以及入侵能力的显著降低,表明该基因对弓形虫的正常生长至关重要。（4）TgANT缺失导致弓形虫严重生长缺陷的原因探究为了证明弓形虫严重的生长缺陷是由于内质网ATP的供应中断导致的,通过生物信息学分析找到了TgANT的两个保守结构域。使用亲疏水性相近的氨基酸对两个保守结构域进行突变,结果表明这两个结构域突变后TgANT不再具有ATP吸收能力。将突变后的TgANT在弓形虫UPRT位点表达后不能够救援iTgANT虫株的生长缺陷,而异源回补哺乳动物的ATP/ADP转运蛋白AXER能够回补相应的表型缺陷。进一步研究表明,TgANT缺失导致的弓形虫内质网ATP供应中断,致使弓形虫出现内质网应激,而这种不可逆转的内质网应激最终引起弓形虫凋亡比例增加。本研究聚焦弓形虫内质网ATP/ADP转运蛋白,证明了弓形虫内质网需要专门的转运蛋白将胞质ATP转运至内质网中,并且内质网中ATP的供应对于虫体生长至关重要,表现出与哺乳动物和植物细胞中完全不同的重要性。本研究为进一步理解弓形虫生长调控的分子机制、研发新型弓形虫防控药物和疫苗等打下基础。
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