沙门氏菌（Salmonella）作为一种人畜共患病原菌,给人类健康和畜禽养殖造成了巨大的威胁。恩诺沙星（ENR）因具有抗菌活性强、生物利用度高、组织分配系数大等优势,是兽医临床治疗沙门氏菌感染的理想药物。然而,ENR苦味极大,严重影响适口性,迄今没有适用于猪的口服制剂上市。此外,近年来沙门氏菌对ENR的耐药性呈逐年递增趋势,为了有效延缓ENR对沙门氏菌耐药性的产生,一方面科学合理的给药方案亟待优化,另一方面发掘优良的耐药抑制剂也是一条重要途径。本研究采用固体分散体（SD）技术研制出适口性好的ENR颗粒剂,完成了制剂组方、工艺研究及质量评价,获得质量合格的ENR-固体分散体（ENR-SD）颗粒剂。构建了PBPK-PD模型评价颗粒剂对猪沙门氏菌的有效性与安全性,并提出了初步的临床给药剂量与休药期标准。在此基础上,以猪沙门氏菌AcrAB-Tol C外排泵基因为关键耐药靶点,筛选出沙门氏菌的耐药抑制剂,并对耐药抑制剂干扰耐性产生的机制进行初步探讨,进一步结合HFIM阐明了抑制剂在ENR治疗动态情况下干扰沙门氏菌耐药耐药进化的机理。主要研究结果如下:1.恩诺沙星固体分散体颗粒剂的制备与质量评价根据ENR的理化性质,以硬脂酸为脂质基质,采用熔融冷却法制备出了一种ENR-SD颗粒剂。首先采用差示量热扫描和X射线衍射法进行原辅料相容性研究,结果显示组方中的硬脂酸、玉米淀粉和Na Cl分别与ENR在40°C/75%（温度/相对湿度）条件下放置1个月和在60°C放置2周没有额外的物质产生,表明所选辅料与ENR相容性良好。ENR-SD表征结果证明该颗粒剂中ENR以非晶体形式存在。适口性试验表明,ENR-SD颗粒剂以混饲给药时不影响猪的正常采食量,具有良好的适口性。该颗粒剂在模拟肠道环境中的体外释放性能与市售宠物用片剂相似,90 min内即可释放完毕。质量和稳定性考核结果表明,ENR-SD颗粒剂的含量、粒度、干燥失重、加速试验等结果均符合兽药典的要求。药动学（PK）结果表明,该颗粒剂在猪血浆的药时曲线下面积（AUC）、峰浓度和达峰时间分别为7.96±1.22μg·h/m L、0.64±0.21μg/m L和1.42±0.34 h。ENR-SD颗粒剂的最终组方为:ENR 5%,硬脂酸50%,玉米淀粉35%,Na Cl 10%。本研究为课题后续工作的开展提供了受试剂型来源。2.ENR-SD颗粒剂对猪沙门氏菌基于PBPK-PD同步模型的有效性与安全性评价首先根据研究目的划分房室血流图、书写质量平衡方程,再通过收集得到猪的生理参数、ENR的理化参数及其动力学等建模参数为平衡方程中的参数赋值,构建出了ENR-SD颗粒剂在猪的PBPK模型,并利用该PBPK模型预测ENR在猪肠内容物中的浓度变化。然后通过PK试验获得了颗粒剂在猪肠内容物中的实际浓度。将该实测浓度与模型预测浓度进行拟合,结果表明实测浓度与预测浓度拟合度较高,线性回归分析方程相关性系数（r）大于0.96,表明模型可以准确预测ENR-SD颗粒剂在猪肠道内容物中的浓度变化。利用PBPK模型进行剂量外推,得到5 mg/kg b.w.剂量下的PK参数(AUC24h),再结合ENR对沙门氏菌的药效学（PD）参数,构建PBPK-PD同步模型。利用Hill方程初步预测出ENR-SD颗粒剂对猪沙门氏菌起到根除作用的PK/PD靶值为AUC24h/MIC=150,对应的给药方案为10 mg/kg b.w.,一天一次。该剂量方案为后续的HFIM试验提供了参考。同时将经验证PBPK模型预测出ENR-SD颗粒剂给药后在肝脏的暴露浓度,结合ENR体外对猪肝细胞的半数抑制浓度,反推得到ENR-SD颗粒剂对猪的靶动物安全剂量范围为≤130 mg/kg b.w.。3.猪沙门氏菌对恩诺沙星耐药抑制剂的筛选及机制研究根据上述得到的ENR对沙门氏菌的MIC分布,挑选临床耐药沙门氏菌16株与敏感菌株进行外排泵基因相对表达量分析。结果表明,在16株耐药菌中,10株菌AcrAB-Tol C外排泵基因（acr A,acr B和tol C）显著上调（p＜0.05）,证明临床猪源沙门氏菌对ENR的主要耐药机制为AcrAB-Tol C外排泵的超表达。在此基础上,通过分子对接从多潘立酮（DOM）、甲氧苄啶、二甲氧苄啶、白藜芦醇、青蒿琥酯、没食子酸、苄达明、舒林酸、香叶醇、辛伐他汀、美伐他汀、姜黄素、吲哚美辛等13个已上市的候选化合物进行潜在外排泵抑制剂（EPIs）的筛选。结果显示,DOM与沙门氏菌AcrB蛋白的亲和力值为-8.9 kcal/mo L,且DOM将ENR对沙门氏菌的抗菌活性提高4倍,表明DOM有作为沙门氏菌EPIs的潜力。采用结晶法、刚果红染色法,动物感染模型等方法研究了DOM在抑制沙门氏菌生物膜形成,减少对宿主致病力等方面的作用。结果表明,DOM可通过减少鞭毛和纤维素等的产生显著抑制沙门氏菌生物膜的形成,并通过抑制沙门氏菌对宿主的侵袭力,显著提高被感染的大蜡螟幼虫和小鼠存活率。对差异基因的GO差异基因富集分析也表明经DOM处理后,差异基因主要集中在运动、驱化和侵袭方面。具体到基因上,在沙门氏菌外排泵被DOM抑制后,编码运动（如鞭毛、菌毛）,趋化和侵袭（SPI-1）功能的基因显著下调,而与复制（SPI-2）和生存相关的基因显著上调。鉴于生存和繁衍是生命体最根本的生理活动,这提示经DOM处理后,也即外排泵被抑制后,沙门氏菌会进入一种“代偿”状态,该状态下沙门氏菌会牺牲掉一些非必须的生理活动而集中更多的能量用于生存、复制等基本必须功能。这提示着DOM在提高ENR的疗效、延缓沙门氏菌耐药性发展中的巨大潜力。4.基于中空纤维感染模型（HFIM）探究耐药抑制剂干扰耐药进化的机理将前期PBPK模型中预测得到的ENR在肠道内容物中的浓度作为模型期望值,通过调整HFIM中蠕动泵的参数,构建出ENR和猪沙门氏菌体外动态互作的HFIM模型。结果表明,HFIM重现浓度与期望浓度拟合线性关系良好（r＞0.92）。在HFIM中监测了ENR-SD颗粒剂分别以5 mg/kg b.w.,10 mg/kg b.w.和20 mg/kg b.w.单独使用时沙门氏菌各亚群的变化。结果显示,72 h时,空白组、5 mg/kg b.w.、10 mg/kg b.w.和20 mg/kg b.w.ENR剂量组浮游菌数量分别为1.01×1011±0.14×1011 CFU/m L,8.80×10~9±1.66×10~9 CFU/m L,2.57×10~9±0.57×10~9CFU/m L和8.97×10~6±3.48×10~6 CFU/m L,表明在动态治疗情况下以20 mg/kg b.w.的剂量(AUC24h/MIC=267)给药才能到达控制沙门氏菌的生长的目的。猜测造成较大差异的原因很可能是传统Hill方程法未考虑耐受亚群的存在。72 h时,各组耐药菌的数量表明各给药组的耐药亚群数量与其浮游菌数量十分接近,表明单纯抗生素治疗时易诱导耐药菌成为优势亚群。在20 mg/kg b.w.组中,12 h已几乎检测不到浮游菌（仅为10 CFU/m L）,而24 h有大量浮游菌检出,这提示着非浮游状态的生物膜亚群向浮游状态转变的存在。且重新生长的浮游菌与其耐药菌数量基本一致（9.7×10~4 CFU/m L/7.3×10~4 CFU/m L）,而该野生型菌株在HFIM系统中的自发耐药突变概率仅为1.58×10-6,猜测基于耐受亚群的耐药突变概率显著高于自发突变概率。这也提示着耐受亚群在沙门氏菌抵抗抗生素和耐药进化中的关键地位。DOM以10 mg/kg b.w.单独使用时生物膜亚群数量为3.5×10~6±0.62×10~6CFU/m L,表明DOM在动态治疗情况下也可显著减少生物膜的产生（p＜0.01）。72 h时,5 mg/kg b.w.ENR组,10 mg/kg b.w.ENR组、20 mg/kg b.w.ENR组、10mg/kg b.w.DOM组和5 mg/kg b.w.ENR+10 mg/kg b.w.DOM组中,滞留菌亚群的数量分别为3.18×10~9±1.45×10~9 CFU/m L CFU/m L,1.37×10~8±0.55×10~8CFU/m L,5.37×10~6±1.38×10~6 CFU/m L,4.80×10~4±1.71×10~4 CFU/m L,and 4.50×10~4±0.66×10~4CFU/m L。可见DOM还可显著减少滞留菌的产生（p＜0.01）。且单独DOM组和ENR+DOM组中滞留菌数量无显著差异,这表明ENR在减少滞留菌上的作用不显著。同时,与空白组相比,DOM显著减少了沙门氏菌的自发突变概率（p=0.0106）。进一步研究表明DOM减少滞留菌产生的原因是其加快了滞留菌的生长速率,KEGG富集分析和KO分析表明该效应的机制可能是DOM上调了细菌的磷脂酰肌醇信号通路,增强了细菌的氨基酸和能量代谢水平,从而加快了滞留菌的生长速率。以上结果表明,ENR单独以20 mg/kg b.w.的剂量给药可有效控制沙门氏菌的生长,5 mg/kg b.w.ENR与10 mg/kg b.w.DOM联用可起到更佳的抑菌防耐药效果;DOM可干扰沙门氏菌耐药进化的机理是DOM可限制耐受亚群的产生并减少细菌的自发突变概率。本课题研制出一种ENR-SD颗粒剂,该颗粒剂的辅料廉价易得、制备工艺简单,极具开发与应用前景。本研究创新性地利用PBPK-PD模型进行新兽药产品的给药剂量、休药期和靶动物安全剂量的预测,将为简化新兽药开发和监管流程提供参考。基于临床沙门氏菌的耐药机制,通过分子对接技术筛选得到了一个安全实用的EPI,并通过转录组学首次从基因组和代谢通路的角度提供了DOM让沙门氏菌进入代偿的证据,这为利用EPIs来限制病原菌提供了坚实的理论基础。并在此基础上通过HFIM阐明了ENR治疗过程中沙门氏菌耐药进化历程;进一步揭示了DOM在减少细菌自发耐药突变概率、抑制生物膜和滞留菌亚群产生中的重要作用,这为了解细菌的耐药进化历程,利用EPIs来提高抗生素的疗效、延缓细菌耐药性的发展提供了可靠的科学依据。本课题开展是响应我国“减抗、限抗”政策号召的一次切实地探索,也为细菌耐药性的精准防控提供了方向。